[发明专利]一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及猪瘟病毒防治技术领域，具体说是一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR（探针法实时定量反转录-聚合酶链反应）试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。

背景技术

古典猪瘟（Classical swine fever, CSF）简称猪瘟，是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起猪的急性、烈性、接触性传染病，我国是猪瘟严重的流行国家之一，每年因猪瘟造成的直接经济损失有数十亿元，严重威胁我国养猪业及其国际贸易的发展。以前采取接种猪瘟兔化弱毒疫苗的方法来预防和控制猪瘟的流行，成功的控制了猪瘟的大爆发。然而，猪瘟的流行特点却从大流行转变为地方性流行和散发，并且不分季节的随时发生。临床特点也从典型猪瘟转变为非典型性猪瘟，诊断和预防难度越来越大，因此猪瘟仍是威胁养猪户的头号传染病。目前，国外和国内均已建立了RT-PCR（反转录-聚合酶链反应）检测方法。国外应用PCR诊断CSFV已取得很大进展，许多学者根据CSFV序列，设计了不同引物，建立了检测CSFV核酸的普通RT-PCR方法、套式RT-PCR方法及复合式RT-PCR方法等。该方法直接从猪的脾脏、全血、淋巴结及肉品等中扩增出预期的片断，但是上述方法耗时长，扩增结束后还需要进行电泳才能观察结果，检测一份样品需耗时7小时左右。同时CSFV是一种高度传染性的病毒，其RNA（核糖核酸）特别容易发生变异，现有的检测方法不具有快速，敏感和准确的特点，需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格便宜的CSFV检测试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确地检测病毒的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包含PrimerScript RT Enzyme Mix II（反转录酶混合液）、One Step RT-PCR bufferIII（一步反转录-聚合酶链反应缓冲液）、Ex Taq HS（具有校正功能耐热脱氧核糖核酸聚合酶）、阴性对照、阳性对照、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。

所述扩增引物序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：

SEQ ID NO:1：上游引物CTGGCCAAGAGGGGTGAGC， 

SEQ ID NO:2：下游引物ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。

所述探针引物序列为：

SEQ ID NO:3：AGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCG。

所述扩增引物扩增出的条带序列为：

SEQ ID NO:4（274 bp）：

ctggccaagaggggtgagccaagaaccctgaagtggattagaaatttcaccgactgtccattgtgggttaccagttgctccgatgatggcgcgagtgggagtaaagagaagaagccagataggatcaacagaggcaaattaaaaatagccccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaggccacctgacgctacgatcgtggtggaaggagtaaaataccaggtcaaaaagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgt。

所述阴性对照为无RNA酶水。

所述阳性对照为含有CSFV基因序列的阳性质粒pMD-274；其构建方式如下：

a. CSFV基因组RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit（凯杰公司核糖核酸提取试剂盒）说明书进行操作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA（互补脱氧核糖核酸）。以SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2作为引物扩增，反应条件为94℃预变性3min；94℃变性50s, 57℃退火50s, 72℃延伸50s, 共30个循环；72℃再延伸10min, 4℃5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

b. PCR产物的克隆及序列分析