[发明专利]一种猪圆环病毒副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗及其制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种疫苗及其制备方法。

背景技术

猪圆环病毒（PCV2）与猪群中发生的多种疾病相关。PCV2的复制需要宿主细胞提供蛋白质，所以PCV2主要侵染分裂速度较快的细胞，例如淋巴细胞、巨噬细胞等。大量研究结果表明，PCV2致病的主要原因是猪感染病毒后引起免疫细胞损伤，表现为淋巴细胞及淋巴组织损伤，致使免疫功能受到抑制。PCV2感染后猪的淋巴结肿大，尤其腹股沟淋巴结肿大明显，淋巴细胞亚群比例失衡，B细胞和T细胞减少，诱导单核和巨噬细胞分化并增殖，但是巨噬细胞吞噬和清除病原的功能出现短暂的下降。PCV2侵入机体后，并不是直接进行增殖或者对细胞产生毒性作用而是与淋巴结中的细胞产生相互作用，这种作用最终会产生两方面效应：一方面使周围淋巴细胞增殖受到抑制从而引起免疫下降，同时由免疫下降可能引发混合感染引起PCV2广泛复制，导致宿主自身的免疫淋巴细胞增殖抑制；另一方面导致细胞凋亡，PCV2的ORF3编码的非结构蛋白与病毒的复制无关，然而可以诱导宿主细胞凋亡。

副猪嗜血杆菌可黏附于呼吸道粘膜上皮，正常情况下不会引起机体发病。当机体抵抗力下降，副猪嗜血杆菌大量增殖会对上呼吸道粘膜造成损伤，引起粘膜表面纤毛活动降低甚至造成纤毛脱落。除造成病灶处纤毛丢失外，还引起鼻粘膜和支气管粘膜的细胞急性膨胀，粘膜损伤可增加细菌和病毒入侵的机会。在副猪嗜血杆菌侵入猪体的最初时期，表现出较为严重的菌血症，主要表现在肝脏、肾脏和脑膜上出现淤血和出血点等败血症样损伤；血浆中可检测到高水平的毒素；许多器官出现纤维蛋白血栓。随着症状的发展，在多种器官表面出现典型的纤维蛋白化脓性多浆膜炎、多关节炎和脑膜炎等。

近几年猪副猪嗜血杆菌病的发生愈见普遍，急性、慢性症状均可见并表现出明显的群体性爆发。临床症状取决于炎性损伤的部位，在高度健康的猪群，发病很快，接触病原后几天内就发病。临床症状包括发热、食欲不振、厌食、反应迟钝、呼吸困难、疼痛（由尖叫推断）、关节肿胀、跛行、颤抖、共济失调、可视粘膜发绀、侧卧。急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产，公猪慢性跛行。猪只皮毛紊乱、苍白、消瘦等逐渐表现出胸腹式呼吸并失去治疗价值，导致猪只高达20-90％的死淘率；急性发作的猪只常来不及治疗而急性死亡，个别猪死亡时口鼻流血并有神经症状表现，在SPF动物或较健康猪群中尤甚。

肉眼可见的损伤主要是在单个或多个浆膜面，可见浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物，这些浆膜包括腹膜，心包膜和胸膜，这些损伤也可能涉及脑和关节表面，尤其是腕关节和跗关节。取纤维蛋白性渗出物于显微镜下观察，可见纤维蛋白、中性粒细胞和较少量的巨噬细胞。副猪嗜血杆菌也可能引起急性败血症，在不出现典型的浆膜炎时就呈现发绀、皮下水肿和肺水肿，乃致死亡。另据报道，副猪嗜血杆菌还可能引起筋膜炎和肌炎，以及化脓性鼻炎等。

发明内容

本发明一方面建立了一种猪圆环病毒副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗的制备工艺，主要包括以下步骤：

一、副猪嗜血杆菌的培养及灭活菌液的制备

步骤1：副猪嗜血杆菌5型接种于含有3%血清及0.004%NAD（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的TSB（Tryptic Soytone Broth，胰蛋白胨大豆肉汤）培养基中，37℃培养12-16小时，通气量为10-15L/h，转速为100r/min；

步骤2：将步骤1所得培养物离心弃上清，用生理盐水重悬菌体，调整活菌数为80-90亿CFU/ml；

步骤3：向步骤2所得菌液加入甲醛灭活。

作为优选，步骤1所述接种为按发酵培养基体积的2%接种菌株。

作为优选，步骤1所述培养为在37℃通气搅拌培养14h，控制培养时间在16h以内，防止培养时间过长导致外毒素的产生，更好地保障疫苗安全性。

作为优选，步骤2所述灭活为用终浓度0.4%的甲醛灭活，于37℃摇床180rpm灭活24h。

二、猪圆环病毒副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗的制备

步骤1：将猪圆环病毒2型接种PK15细胞后培养48-60h，测定TCID₅₀到达8×10⁷/ml；向收获的病毒液中添加0.2-0.3%的甲醛对病毒液进行灭活；将获得的灭活病毒液与副猪嗜血杆菌5型灭活菌液混合；

步骤2：向步骤1所制备的病毒、细菌混合液中加入德国进口水溶性GEL佐剂进行疫苗的制备；