[发明专利]厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株。 

背景技术

Streptomyces xiamenensis的模式菌株是分离自中国福建省红树林沉积物的一株链霉菌，在此菌株的发酵液中，发现了一苯并吡喃衍生物： 

N-[[3，4-dihydro-3S-hydroxy-2S-methyl-2-(4′R-methyl-3′S-pentenyl)-2H-1-ben zopyran-6-yl]carbonyl]-threonine，结构式如下： 

此化合物由3个结构单元构成：L-苏氨酸、4-羟基苯甲酸和香叶草基。这类化合物有较低的细胞毒性、良好的细胞膜穿透性。据报道此化合物具有抑制ICAM-1(细胞间粘附分子-1)/LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)介导的细胞粘附作用，具有开发为抗炎和抗纤维化药物的潜力。异戊烯基取代的苯并吡喃类化合物，主要来源有：植物提取、全化学合成和化学酶学合成，本发明涉及利用微生物培养生物合成此类化合物。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株，具体为从厦门链霉菌中克隆并获得苯并吡喃类生物碱(厦门霉素)的生物合成方法及通过异源表达在其它链霉菌中生物合成该化合物，并通过引入抗生素抗性提高该化合物产量的方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的， 

第一方面，本发明涉及一种厦门霉素的生物合成基因簇，所述基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，全长为5189个碱基。 

优选的，所述基因簇包含基因ximA，ximB，ximC，ximD和ximE；具体为： 

ximA：位于SEQ ID NO.1第1-1563碱基处，编码520个氨基酸； 

ximB：位于SEQ ID NO.1第1788-2729碱基处，编码313个氨基酸； 

ximC：位于SEQ ID NO.1第2795-3385碱基处，编码196个氨基酸； 

ximD：位于SEQ ID NO.1第3394-4815碱基处，编码473个氨基酸； 

ximE：位于SEQ ID NO.1第4815-5189碱基处，编码124个氨基酸。 

第二方面，本发明涉及前述生物合成基因簇在生产厦门霉素中的用途。 

第三方面，本发明涉及一种厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5670。 

第四方面，本发明涉及如前述的厦门链霉菌的突变菌株，通过将突变型rpsL基因转入所述厦门链霉菌而得。 

优选地，所述突变菌株为厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5674、厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5675或厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.5676。 

第五方面，本发明涉及一种厦门霉素的生产方法，取前述的厦门链霉菌或其突变菌株或携带前述的厦门霉素生物合成基因簇的基因工程菌株，发酵，可得厦门霉素。 

本发明的厦门霉素生物合成基因簇的克隆及其异源表达的方法具体为： 

步骤一，提取该链霉菌的基因组DNA，建立Fosmid文库； 

步骤二，根据该基因组扫描的结果，用针对异戊烯基转移酶设计的引物对待选菌株基因组文库进行PCR扩增，筛选到阳性克隆p9A11； 

步骤三，以p9A11为模板设计引物，该PCR产物大小为7.5K，覆盖整个基因簇，将此PCR产物连接在pMD18-T载体上。筛选到阳性克隆子后，酶切，将插入片段再与载体pJTU1278相连，构建载体pLMO09403。 

步骤四，使用PCR Targeting技术，敲除该基因簇中的ximA、ximB、ximC、ximD、ximE，再将突变质粒导入出发菌株中，敲除相应的基因； 

步骤五，经HPLC分析后，ximB、ximC、ximD、ximE突变株发酵液上清中，该苯并吡喃化合物均消失，而ximA突变株中产生了一个中间代谢产物(厦门霉素B)，从而证实该基因簇为此苯并吡喃化合物的生物合成基因簇；