[发明专利]一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体是指一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒及检测方法。

背景技术

黄病毒科中多种病毒能引起人类和动物的严重疾病，特别是脑炎和出血热，有较高的死亡率。该类病毒感染的临床表现比较复杂，常常被误诊或冠以“无名热”。目前在我国常见的黄病毒感染有登革热和乙型脑炎，随着改革开放和旅游事业的发展，可能还会有新的黄病毒出现，如西尼罗病毒目前在全球范围内仍呈现继续扩散的趋势。上海市作为国际化大都市，国际国内货物、人员往来不断增加，使西尼罗病毒通过动植物等货物传入的风险性很大。2012年上海市常住人口达2300万以上，大量境外人口入境带来突发传染病的严重威胁以及敌对势力在我市举办大型国际活动期间有实施生物恐怖袭击的潜在危险等，可预见的后果非常严重。因此有必要进行完善的技术储备，加强突发传染病病原体来源追踪和早期快速侦检研究对及时控制急性传染病疫情和生物灾难意义重大，但目前对于这些疾病的早期快速诊断尚无完善的方法。

1.流行性乙型脑炎(乙脑)病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，有包膜的单正链RNA病毒，三带喙库蚊为主要传播媒介，主要在亚洲流行，可引起严重的神经系统传染病，致死率高达30％左右；另有50％的患者会留下永久性的神经系统后遗症。据统计，亚洲每年乙脑发病人数达16000例左右，死亡5000例左右，中国除新疆、西藏、青海外，其它各省均有发病与流行，脑炎发病数占世界总发病数的80%以上，是危害我国人民生命及畜牧业的最重要的虫媒病毒之一。近年澳大利亚本土和美国的关岛地区也出现乙脑病例，说明该病的流行区域在不断扩大，已成为严重的公共卫生问题。故加强对其监测和诊断是十分必要的。

乙型脑炎病例的诊断主要依靠流行病学、临床特征和实验室检查三方面证据。实验室检查主要有血清学诊断、分离培养和分子生物学方法。然而，主要针对抗体的血清学诊断方法不能在疾病早期提供有力的诊断证据，不利于病人的早期诊断和治疗。病毒分离培养方法耗时、费力，检出率低。RT-PCR方法虽然灵敏并能在早期对病毒进行检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而使用受到限制。实时荧光定量PCR技术虽然具有高度特异性和精确度、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点，但由于实验成本高，使用仪器精良而不宜在基层和现场使用。

2.登革病毒(dengue virus，DV)属黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，根据抗原性不同，可将登革病毒分为1、2、3、4四个血清型。登革病毒感染(dengue virus infect，DVI)可引起登革热(dengue fever，DF)和登革出血热(dengue hemorrhage fever，DHF)，后者死亡率较高。登革热是一种热带传染病，主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，其传染性仅次于艾滋病和SARS。近年来，登革热广泛流行于100多个国家和地区，特别是东南亚一带的流行甚为严重。据世界卫生组织报道，每年约有0.8～1亿例DVI，50万例DHF，2.5万人死亡，15亿人受到威胁。DHF的流行从1954年起迅速上升，2000年登革热曾在秘鲁流行，共有2.45万人被感染。2004年初，拉美9个国家共有27万人感染登革热。在我国登革热属于输入性流行，1978年广东省佛山市首次从病原学确诊登革热流行以来，我国共有650万人感染DV，500多人死亡。登革热临床表现复杂多样、传播迅速、发病率高、人群易感染，严重影响了人们的生活质量和身体健康。由于登革热没有特异性的治疗方法，也没有有效的疫苗进行预防，因此及时发现登革热疫情、阻止或减少本地登革热疫情传播就变得尤为重要。故研究快速检测方法在登革热的预防和控制中具有重要意义。

目前，登革病毒感染的诊断，主要依靠病毒分离和血清学检测。病毒分离法费时繁琐、至少需1周时间才能出结果，达不到早期快速诊断的目的。血清学诊断因与其他黄病毒存在广泛的交叉反应而受到干扰。近年来，随着分子生物学技术的不断发展与完善，以及技术服务市场化，对登革病毒感染的诊断，已经从传统的病毒分离、血清学检查，进入到对病毒RNA进行分子检测的新阶段，为登革热早期诊断和流行监测提供了有效手段，如RT-PCR，nested-PCR，Real-time PCR，TaqMan探针，基因芯片等，但这些技术方法或由于出现假阳性，或由于检测烦琐，成本高，实验室及仪器设备要求精良等，均不适宜在基层和现场使用。