[发明专利]一株高产葡萄糖-6-乙酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法

权利要求书

1.一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)GXU-011，保藏号为:CGMCC No.7031，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年12月24日，保藏地址：中国科学院北京微生物研究所。 

2.如权利要求1的芽孢杆菌GXU-011,其特征在于，所述的芽胞杆菌GXU-011菌落特征和生理生化特征为：细胞形态为直杆状，无孢子形成，革兰氏染色为阳性；平板培养基中30℃培养36h，菌落直径为2～3mm，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，淡黄色，表面光滑。有接触酶反应；V-P实验阴性；能够利用葡萄糖产酸，不能利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸；明胶液化：缓慢；能够水解淀粉；能够利用柠檬酸盐；能够还原硝酸盐；不能利用丙二酸；最适生长温度为20～30℃。 

3.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GXU-011,其特征在于，所述的芽孢杆菌GXU-011序列测定与系统发育树分析： 

根据已知的16S rDNA上保守序列设计寡核苷酸引物：FW：5＇-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3＇，RV：5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇以GXU-011细菌基因组DNA为模板，使用引物进行PCR扩增16S rDNA序列基因,16S rDNA的扩增反应程序：PCR反应程序设定为：先95℃预变性5min；然后94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环30个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min； 

扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果正确则使用PCR产物纯化试剂盒纯化基因片段，再将其连入pMD18-T载体上，PCR验证后送出测序，所 得到的测序结果与Genbank数据库中的序列进行比对，从而初步鉴定菌株种属。利用BLAST将所测得序列与GenBank数据库中的16SrDNA基因序列进行同源性比较分析，选取1400bp左右的长度进行比对[Clustelx(1.81)]，采用邻位连接(Neighbour Joining，NJ)法进行系统学分析(MEGA)，确定了菌株GXU-011与其它几株Bacillus sp.菌株的系统发育树，结果显示菌种GXU-011的16S rDNA基因序列与GenBank中许多芽孢杆菌（Bacillus sp.)的16SrDNA基因序列的同源性在99％以上，所以将菌种GXU-011命名为芽孢杆菌GXU-011(Bacillus sp.)。 

4.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GXU-011,其特征在于所述的芽胞杆菌GXU-011的16SrDNA序列为： 

5.如权利要求1的芽孢杆菌GXU-011的培养方法，其特征在于：用权利要求1所述的芽孢杆菌GXU-011生产葡萄糖-6-乙酸酯，生产步骤如下： 

1）将芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株GXU-011菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；工艺条件为pH6.5～7.5、温度25～35℃、培养时间24～36小时； 

2）将斜面菌株扩大培养作为种子液，所述种子液由以下重量份组分组成：葡萄糖20～60份、酵母粉1～4份、氯化钾0.5～2份、碳酸钙0.5～2份、磷酸氢二钾2～6份、磷酸二氢钾2～6份、硫酸镁2～6份和水1000份； 

3）将种子液接入发酵罐中进行发酵： 

所述发酵液由以下重量份组分组成：葡萄糖20～60份、酵母粉1～4份、氯化钾0.5～2份、碳酸钙0.5～2份、磷酸氢二钾2～6份、磷酸二氢钾2～6份、硫酸镁2～6份和水1000份； 

发酵的工艺条件为发酵液接种量为5%～10%，pH值为6.5～7.5，培养温度25～35℃，搅拌速率为150～200转/分钟，发酵时间为48～72小时，得到葡萄糖-6-乙酸酯反应液； 

4）将葡萄糖-6-乙酸酯的分离纯化，包括以下2个步骤： 

（1）将步骤3）葡萄糖-6-乙酸酯反应液经过硅胶柱进行分离纯化，所述硅胶柱为硅胶G柱； 

（2）把经过步骤（1）的发酵液真空干燥，真空干燥度为0.1Mpa，温度为65℃，即得淡黄色粉末纯度为92%的葡萄糖-6-乙酸酯。