[发明专利]猪链球菌2型htpsA基因敲除突变株及其应用

权利要求书

1.猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2）htpsA基因敲除突变株05ZYH33△htpsA，其特征在于，05ZYH33菌株中的htpsA基因从第31位至1000位之间的编码基因被壮观霉素抗性基因盒所代替，该突变菌株的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7375，保藏日期为2013年3月28日。

2.根据权利要求1所述的猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2）htpsA基因敲除突变株，其特征在于所述的05ZYH33菌株中的htpsA基因从第31位至1000位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2）htpsA基因敲除突变株，其特征在于所述的壮观霉素抗性基因盒序列如SEQ ID NO.3所示。

4.构建权利要求1所述的猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2）htpsA基因敲除突变株的方法，其特征在于包含以下步骤：

⑴根据如SEQ ID NO.2所示的S.suis2野生株05ZYH33基因组htpsA编码基因的上游DNA序列，设计PCR特异引物LA1和LA2；根据如SEQ ID NO.4所示的S.suis2野生株05ZYH33基因组htpsA编码基因的下游DNA序列，设计PCR特异引物RA1和RA2；以pSET2质粒为模板，设计一对特异引物spc-F和spc-R；其中引物LA1序列如SEQ ID NO.5所示，引物LA2序列如SEQ ID NO.6所示，引物RA1序列如SEQ ID NO.7所示，引物RA2序列如SEQ ID NO.8所示，引物spc-F序列如SEQ ID NO.9所示，引物spc-R序列如SEQ ID NO.10所示；

⑵以05ZYH33基因组DNA为模板，分别以LA1/LA2和RA1/RA2为引物，扩增得到两端分别含Sph I/Sal I酶切位点的目的基因htpsA上游DNA序列LA片段和两端分别含BamH I/Kpn I酶切位点的目的基因htpsA下游DNA序列RA片段；以pSET2质粒为模板，以spc-F/spc-R为特异引物扩增得到两端分别含Sal I/BamH I酶切位点的壮观霉素抗性基因盒；

(3)基因敲除载体pUC::htpsA的构建：将所述的LA片段-壮观霉素抗性基因盒-RA片段插入pUC19载体的Sph I/Kpn I酶切位点间得基因敲除载体pUC::htpsA；

(4)基因敲除载体pUC::htpsA电转化制备好的S.suis2野生株05ZYH33感受态细胞；

(5)筛选具有壮观霉素抗性的猪链球菌菌落，经组合PCR产物电泳、RT-PCR和DNA测序证实htpsA目的基因被壮观霉素抗性基因盒替换，即得到保藏号为CGMCC No.7375的猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2）htpsA基因敲除突变株05ZYH33△htpsA。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的基因敲除载体pUC::htpsA的构建包含如下步骤：

(a）RA的克隆：将BamH I/Kpn I双酶切后的RA片段与用同样内切酶双酶切处理过的pUC19载体进行连接，得重组质粒pUC19-RA；

(b)壮观霉素抗性基因盒的克隆：将Sal I和BamH I双酶切后的产物与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC19-RA进行连接，得重组质粒pUC19-SR；

(c)LA的克隆：将Sph I/Sal I双酶切后的LA片段与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC19-SR进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经壮观霉素和氨苄青霉素双重筛选后，用Sph I和Sal I进行双酶切鉴定，筛选出有970bp左右大小DNA片段出现的阳性质粒；并分别用LA1/LA2、RA1/RA2、spc-F/spc-R、LA1/spc-R、spc-F/RA2、LA1/RA2六对引物分别做质粒PCR鉴定，得到的阳性重组质粒为pUC::htpsA。