[发明专利]一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法。

背景技术

家蚕（Bombyx mori L.）属于鳞翅目经济昆虫，在我国已经被人工驯养5700多年，经过长期的人工选择和培育，形成了具有不同生产性能的品种资源。但由于家蚕长期在室内饲养，其对化学农药的抗性较弱。每年由于化学农药引起中毒，我国的蚕茧产量减30%左右。

有机磷农药特别是辛硫磷农药，是化学农药中常用的一种，有机磷使家蚕中毒的机理是进入蚕体的机磷农药和乙酰胆碱酯酶(AChE)结合，使其活性降低，不能水解神经突触中神经传递物质乙酰胆碱，导致乙酰胆碱连续对突触后膜刺激，引起家蚕抽搐而中毒死亡。

家蚕具有两种乙酰胆碱酯酶基因类型，已有的研究表明，其中1型(Bmace1)的基因表达量是2型(Bmace2)100倍以上；并且Bmace1的功能和其对农药的抗性相关。

因此研究一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法，以制备出对辛硫磷农药敏感性较低的家蚕1型乙酰胆碱酯酶，为转基因培育家蚕抗药性品种提供重要素材，对于提高家蚕对辛硫磷的抗性具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶（BmAChE1）对辛硫磷敏感性的方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法，包括以下步骤： 

（1）克隆家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因，具体为取经常规饲养的家蚕幼虫，提取家蚕总RNA，经DNA酶处理后，反转录制备cDNA；以家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因为目的基因设定PCR扩增引物，进行RT-PCR扩增；将扩增产物克隆进pGEM-T载体获得重组质粒，对质粒DNA进行测序，选出序列正确的质粒DNA；

所述PCR引物为SEQ ID No.1：TTGTGGGTGTAGGTGCCAGCGACGGTAT以及SEQ ID No.2：ACTTATATGGTGTATTTGAACAGTGCTGTGCCTGTA；

（2）定点突变家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因的四个核苷酸位点，具体为以步骤（1）中测序正确的质粒DNA为模板，首先以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序；再以测序正确的质粒DNA为模板，用SEQ ID No.5、SEQ ID No.6引物进行第二次进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序；最后以测序正确的质粒DNA为模板，用SEQ ID No.7、SEQ ID No.8引物进行第三次进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序鉴定；选取测序正确的序列即为突变后的家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因序列；

所述四个核苷酸位点为907位G→T、986位G→C、1660位C→T以及1661位T→C；

（3）定点突变基因的表达，具体为将步骤（2）获得的突变后的家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因去除信号肽后克隆到杆状病毒转移载体中，转化E. coli DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒，转染sf9细胞，对sf9细胞表达产物进行纯化即获得了对辛硫磷敏感性低的家蚕1型乙酰胆碱酯酶；

所述引物SEQ ID No.3为：TTATTCGGTGAATCATCGGGAGCCGTGTCAG；

SEQ ID No.4为：CTGACACGGCTCCCGATGATTCACCGAATAA；

SEQ ID No.5为CTATCATGCAGTCTGCAGCCGCCACTGCTCC；

SEQ ID No.6为GGAGCAGTGGCGGCTGCAGACTGCATGATAG；

SEQ ID No.7为：GTTCGGGGAGCCTTCCAATCCCGGGAAA；

SEQ ID No.8为：TTTCCCGGGATTGGAAGGCTCCCCGAAC。

上述技术方案中，步骤（1）中对家蚕的个体进行总RNA的提取，需要去除中肠内容物，以减少食物残渣对实验结果的影响。

上述技术方案中，所述步骤（1）中采用DNA酶对总RNA处理，以减少残留的基因组DNA对实验的影响。

上述技术方案中，步骤(2) 中，通过三次PCR扩增对四个核苷酸位点突变， 1660位C→T、1661位T→C由于靠在一起，可以在一次PCR扩增中进行两个突变，提高生产效率。