[发明专利]一种以月经产物制备间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以月经产物制备间充质干细胞的方法。 

背景技术

随着干细胞研究的兴起，特别是对成体干细胞的深入研究，使得体外分离培养不同组织来源的干细胞并建立相应的细胞系成为可能。其中，有关间充质干细胞的体内分布、体外分离、培养、诱导分化、发育潜能等的研究已经取得了突破性进展。由于间充质干细胞在成体组织中分布广泛，易于获取，并且可以在体外模拟体内的条件下大量扩增培养，最重要的是其诸多的临床应用潜能已被证实，例如在组织工程创伤、烧伤、缺血坏死、骨髓损伤等修复过程中必不可少，而且在细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面有着广泛的应用前景。因此，间充质干细胞已成为一种生物医学工程领域的“明星细胞”，引起越来越多的科学家、新闻工作者、普通民众等人群的强烈关注。 

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）主要来源于胚胎发育早期的中胚层，其具有自我更新、多向分化和调节免疫等特点。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育的多种组织中，用的最多的也是骨髓来源的间充质干细胞。但是骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的增加，干细胞数量及其增殖分化能力显著降低；取材时对患者有损伤；有骨髓疾病时无法采集；即使是健康供者，亦不能抽取过多的骨髓。这些缺点都限制了骨髓来源间充质干细胞的应用。 

近年来，也有研究者提出从新生儿月经产物来源血里分离提取间充质干细 胞，并且证实月经产物来源血来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞具有相似的生物学特性、免役表型、分化潜能等。但月经产物来源血来源的间充质干细胞分离效率较低，难以在细胞治疗及组织工程领域广泛应用。也有报道从胎儿的肝脏、肾脏、肺脏等部位分离提取间充质干细胞，但是来源于胎儿的间充质干细胞在临床应用时显然受到伦理道德及传统观念的限制。因此，寻找一种简单易行而且没有伦理道德限制的间充质干细胞来源已成为当务之急。 

各项研究显示，伴随女性月经周期脱落的子宫内膜组织及血液成分中可以分离出大量间充质干细胞，并可在体外培养条件下大量扩增并保持其生物学特性不发生改变。相比骨髓/月经产物来源/月经产物来源血/胎肝/胎肾/胎肺等来源的间充质干细胞，月经产物来源的间充质干细胞分离方法简单、易于大量扩增培养，并且在采集月经血产物时没有痛苦、可多次采集、采集没有论理障碍限制等一系列的优点，月经产物势必成为一种新的可供科研及临床使用间充质干细胞来源。 

发明方法 

本发明的目的在于提供一种新的制备间充质干细胞的方法：以女性月经产物为原料，通过月经产物的采集、预处理、细胞的分离、培养、冻存等方法保存月经产物来源的间充质干细胞。该方法具有工业化简单、易于操作的优点，利用本发明的方法可以从月经产物中分离得到间充质干细胞，并可通过传代培养、冻存等方法制备及保存大量的间充质干细胞以满足科研及临床需求。 

本发明通过下述技术方案实现的。 

一种新的间充质干细胞的制备方法： 

1、一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于： 

（1）月经产物采集 

收集月经开始第2~3天的月经产物，将月经产物加入样本采集管内，样本采集管内的采集液为100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml及200U肝素，样本采集管可在0~12℃存放36小时； 

（2）月经产物预处理 

将采集的月经产物全部转移至样品杯中，加入0.1%~0.2% Ⅳ胶原酶，将样品杯封口后置于37℃恒温培养箱内震荡孵育，100~150转/分钟，30~60分钟； 

（3）分离间充质干细胞 

将孵育后的液体用100μm细胞筛网过滤，收集滤液，采用密度梯度离心收集单个核细胞的方法收集消化液内的月经产物来源间充质干细胞，具体操作为：在离心管内加入淋巴细胞分离液，将滤液叠加至淋巴细胞分离液上，在室温下离心，2000转/分钟，15分钟，离心结束后可见淋巴细胞分离液层上清晰的白膜层，吸取离心后上清液至离心管，加入pH7.0~7.4的磷酸盐缓冲液，用电动吸液器吹打混合至均匀，1500转/分钟，离心10分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀；沉淀中加入pH7.0~7.4的磷酸盐缓冲液，1000转/分钟，离心5分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为原代月经产物来源间充质干细胞； 

（4）扩增间充质干细胞