[发明专利]基于可感染病毒颗粒型抗体重链库/轻链库的抗体筛选和制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，并涉及抗体筛选技术领域。更具体地，本发明涉及一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的建立以及新型抗体筛选方法。

背景技术

抗体分子是生物医学领域用途最为广泛的蛋白分子，治疗性抗体和诊断用抗体更是具有广泛应用前景和巨大的市场价值。自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体如人源化抗体、单价小分子抗体、多价小分子抗体等不断出现。

杂交瘤细胞技术给单克隆抗体生产技术带来了革命性变化，大大推动了抗体的应用进程，但由于该技术须经动物免疫、细胞融合、克隆筛选等复杂漫长的工艺流程，且具有不能制备针对稀有抗原的抗体和人源性抗体等缺陷，从而限制了基因工程抗体更为广泛的应用。抗体库技术使人们找到了解决这些问题的有效途径，其中噬菌体抗体库是应用最为普遍的抗体库技术。采用这种技术筛选抗体无需进行动物免疫，没有细胞融合、克隆筛选等过程，为全方位制备各类抗体提供了捷径。核糖体展示抗体库技术是近年来发展出来的另一抗体筛选技术，整个过程体外进行、不经大肠杆菌转化步骤，易于筛选高亲和力抗体和采用体外方法对抗体性质进行改造，但该技术对免疫动物易于执行而对人源抗体的筛选不具优势；而且深入研究表明：利用各种抗体文库所进行的大量筛选，其产物常常因为对抗原亲和力低、特异性差等原因而达不到预期要求；Roger R.Beerli等人新近建立了一种新型抗体筛选方法——哺乳细胞展示法，但该方法仍无法摆脱单链抗体的束缚。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有抗体筛选技术中杂交瘤细胞技术不能制备针对稀有抗原的特异性抗体和人源化抗体等缺陷；针对各种建立在抗体文库基础上的抗体筛选技术出现的抗原亲和力低、特异性差等缺陷；针对哺乳动物细胞展示技术不能制备单链抗体的缺陷，分别建立一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和一种可感染病毒颗粒型抗体轻链库，利用所述抗体库建立一种新型抗体筛选方法，筛选更加逼近体内条件的、高特异性且高亲和性的人源化抗体。

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种抗体筛选方法，包括：抗体库构建步骤：构建可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库；第一筛选步骤：利用所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库感染动物细胞，采用特异性抗原筛选被感染的、具有特异性抗体表达能力的动物细胞，获得阳性细胞株；第二筛选步骤：从所述阳性细胞株获取所述特异性抗体的重链可变区cDNA序列和轻链可变区cDNA序列，拼接引入所述特异性抗体的轻链信号肽序列，连接插入表达载体，构建所述特异性抗体的表达细胞株，以表达制备所述特异性抗体。

本发明还提供一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的构建方法，包括；分别获取人IgG重链可变区多组合系列基因序列、人IgG轻链可变区多组合系列基因序列、IgG家族可变区基因序列、和人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列；构建含有T-A连接序列、信号肽序列和跨膜序列的穿梭载体；将获取的所述人IgG重链可变区多组合系列基因序列、所述人IgG轻链可变区多组合系列基因序列、所述IgG家族可变区基因序列、和所述人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列连接插入所述穿梭载体，构建得到重组穿梭质粒库；利用重组穿梭质粒库和腺病毒重组系统构建所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和所述可感染病毒颗粒型抗体轻链库。实施本发明的技术方案，可以获得以下技术效果：本发明建立的一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库可以在哺乳动物细胞中通过感染方式繁殖扩增，长期保存；包含尽可能完整的人类IgG重链可变区和轻链可变区序列、IgG家族可变区序列以及根据人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区进行除无义突变以外的随机突变，保证可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的最大丰度，保证抗体库的容量；保证抗体分子表达在细胞表面，呈现更加天然的抗体形态，便于后续的新型抗体筛选方法的建立；特异性抗体重链、轻链被分泌型表达在细胞外，保证了工程抗体的天然状态，便于后续的纯化生产。可以用于筛选多种特异性抗原——如肿瘤抗原、病毒抗原等的相应的、高特异性、高亲和性、近似天然抗体。