[发明专利]一种猪乙型脑炎病毒弱毒株

说明书

技术领域

本发明属于禽畜致病微生物筛选技术领域，具体涉及一种猪乙型脑炎病毒弱毒株。

背景技术

猪乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus JEV)引起的由媒介蚊虫传播的一种人畜共患的急性传染病。该病对人类危害巨大，病死率高，而且后遗症严重。而我国更是乙脑发病率最高的国家，占世界总发病人数的80%。同时，乙脑还是危害养猪业的重大疫病之一，能引起妊娠母猪流产和死胎、公猪睾丸炎和仔猪死亡等临床症状，给养猪业的持续高产发展造成了巨大的经济损失。猪是乙脑的主要传染源之一，它与蚊形成了“蚊－猪－蚊“的传播模式，该病以其传播地域广，危害大，一直成为一种严重的急性的人畜共患传染病。近年来其流行分布范围有不断扩大的趋势，1999年我国农业部将猪流行性乙型脑炎归为二类动物疫病。

为了解我国生猪主产区猪乙型脑炎感染情况，易邦公司技术中心协同中国动物卫生与流行病学中心于 2008年 5 月至 2009 年 5 月，对辽宁、河北、河南、山东、浙江、福建、江西、安徽、湖南、广西、云南和四川等12个省份的部分猪场猪乙型脑炎血清抗体的流行病学进行调查、采样及检测，共采集11740份血清样本，总体样品的JEV IgG抗体阳性率为38.82%。其中，6个省份的血清抗体阳性率低于50%，分别是：辽宁14%、河北24.01%、河南31.41%、山东37.53%、云南41.81%、四川46.04%；另6个东、南部省份的抗体阳性率分别为：安徽51.19%、江西56.34%、湖南59.92%、浙江62%、福建78.84%、广西85.81%。结合调查情况来看，我国猪乙型脑炎感染率相对较高，免疫保护效果较低。

在兽用疫苗方面，我国目前猪用乙型脑炎疫苗主要是鼠脑灭活疫苗，该疫苗具有注射剂量大、需多次注射、效果不稳定及免疫力不持久等不足之处。湖北农科院畜牧兽医研究所1999年推出了猪用减毒活疫苗，弱毒疫苗虽然保护性好，但也不能完全保护猪群免受乙脑病毒的侵袭。现有疫苗远不能满足防疫工作的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪乙型脑炎病毒弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对目前国内流行的猪乙型脑炎病毒的攻击能提供良好的免疫保护效力。

本发明的猪乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus) YBJE株，该病毒株于2012年10月31日保藏在北京市朝阳区大屯路中国科学院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.6753。

本发明筛选的弱毒疫苗株采用BHK-21细胞和乳鼠皮下传代方法并结合蚀斑纯化技术选育获得的，可用来制备预防猪乙型脑炎活疫苗。

本发明筛选的猪乙型脑炎病毒弱毒疫苗株，在BHK-21细胞上连续传代，脑内接种小鼠，不引起发病和死亡；该株细胞18代毒，再用乳猪连续传5代，仍不引起小鼠发病和死亡；该病毒接种仔猪后未有发病现象，血液和脑组织中未回收到病毒；接种怀孕30天的初产母猪，接种后21日剖杀，胎儿均健活，胎盘、羊水及胎儿脑组织乙脑病毒PCR检测均为阴性。本发明筛选的乙脑弱毒疫苗株遗传性稳定，符合猪乙型脑炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

一、本发明猪乙型脑炎弱毒YBJE株的筛选

1、BHK-21细胞传代  挑选长成良好单层的BHK-21细胞，经PBS液洗涤后加适量维持液，接种病毒含量为10^5.0TCID₅₀/ml的乙型脑炎病毒JEV-SD0601株，置35～36℃、5%CO₂条件下静止培养，培养72～96 小时后，细胞出现明显病变时收获病毒液，如此连续传18代。

2、乳鼠皮下接种传代  将纯化后经BHK-21细胞克隆株病毒悬液接种1～3日龄乳鼠，每只皮下注射0.1ml，接种7日后剖杀取脑组织收获病毒。