[发明专利]一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种嗜热毛壳菌纤维素酶，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列选自以下:

(a)N末端氨基酸具有SEQ ID NO.5所示序列；

(b)C末端氨基酸具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的序列；

(c)包含由(a)或(b)的序列发生一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入或添加且与(a)或(b)具有纤维素酶活性的氨基酸序列；

(d)包含与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的序列的蛋白质至少90%同源性的序列，且具有纤维素酶活性的氨基酸序列。

2.一种嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1）嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQ ID NO.2所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；

2）嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3）里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，分泌到细胞外的嗜热毛壳菌纤维素酶为SEQ ID NO.3所示序列的第22-314位氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤2）具体为：将步骤1）所得的产物由SacⅡ和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建。

4.如权利要求2所述的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤3）具体为：首先，用EcoRI降解步骤2）构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUT C-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析；所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。

5.一种嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1）嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQ ID NO.4所示；

2）嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3）毕赤酵母的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.如权利要求5所述的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤2）具体为：将步骤1）所得的产物由StuⅠ和KpnⅠ限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建。

7.如权利要求5所述的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤3）具体为：首先，用Spe I限制性内切酶将步骤2）构建的表达质粒切开后，直接转化毕赤酵母菌；随即挑选多个白色毕赤酵母菌落、培养、诱导后，将菌体与培养液分离，培养液通过SDS-PAGE电泳分析。

8.一种采用权利要求2-4任一项所述的方法制得的嗜热毛壳菌纤维素酶在制备纺织物除毛产品中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

9.一种采用权利要求2-4任一项所述的方法制得的嗜热毛壳菌纤维素酶在制备牛仔布水洗产品中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

10.一种采用权利要求5-7任一项所述的方法制得的嗜热毛壳菌纤维素酶在制备牛仔布水洗产品中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。