[发明专利]一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种利用黄杆菌诱变选育及提高发酵水平的方法，尤其涉及的是一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法。

背景技术

维生素K是一类脂溶性维生素，结构为一系列含有2-甲基-1,4-萘醌的多烯化合物，天然存在的维生素K根据其侧链形式不同可以分为维生素K1和维生素K2两种，维生素K1在绿色植物与动物肝脏中含量丰富，维生素K1为系列化合物,淡黄色晶体,主要由肠道细菌合成；维生素K2是根据C-3上异戊二烯侧链的长短来定义的,异戊二烯侧链一般含有4-13个异戊二烯单元，以MK-n表示（n指侧链上异戊二烯单位的个数；其中最重要的是MK-4和MK-7。维生素K2生物合成途径是由异戊二烯侧链合成途径与萘醌骨架合成途径组合而成的。维生素K2具有良好的促进凝血、预防和治疗骨质疏松的功效，同时还能改善动脉硬化，对肝癌和白血病也有预防和治疗作用，早在1995年日本已经将维生素K2作为骨质疏松治疗药物。目前，维生素K2主要用化学手段合成，利用微生物法生产维生素K2还处于起步阶段。由于化学法存在环境污染和产物生物活性低等问题，而生物法生产的维生素K2可使血清维生素K2保持较高水平。

从目前的文献看，能够进行发酵生产MK的菌种主要是属于革兰氏阴性菌的黄杆菌(Flavobacterium)，主要产MK-4；属于革兰氏阳性菌的枯草杆菌(Bacillus subtilis natto，日本文献称之为纳豆菌)，主要产MK-7。

由于黄杆菌是野生菌株，发酵水平低，时间长，需要进行诱变筛选提高产量。离子束注入和低温等离子照射是两种新兴的高效诱变手段，具有对生物体损伤小，突变谱广，正突变频率高的等特点。另外，在黄杆菌发酵过程中，由于MK-4在黄杆菌胞内积累，引起产物抑制，降低了MK-4的产量，需要能降低产物抑制的新方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，提高黄杆菌发酵生产维生素K2的水平。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

（1）将黄杆菌原始菌株在培养基上活化；

（2）将黄杆菌菌液涂布于无菌平皿上，风干，进行N⁺或Ar⁺离子注入，洗脱后移至含维生素K2类似物的初筛平板培养基上培养，挑选生长旺盛菌落，作为初筛菌落，将初筛菌落转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选维生素K2产量高菌株作为复筛结果，并移至斜面培养基保藏；

（3）将上述高产菌株菌液，涂布于无菌平皿上，风干，进行低温等离子体照射，洗脱后移至初筛平板培养基上培养，挑选生长旺盛菌落，作为初筛菌落，将初筛菌落转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选维生素K2产量高菌株作为复筛结果，并移至斜面培养基保藏，重复步骤（2）和步骤（3）2～4次，获得维生素K2高产黄杆菌，发酵单位提高50～100%；

（4）将黄杆菌菌株接入种子培养基中培养，按接种量5～10%接入发酵培养基，在发酵培养基中添加0.1～5%表面活性剂，在30～37℃培养3天，胞内维生素K2溶至胞外，维生素K2产量提高50～200%。

所述步骤（1）中，黄杆菌由中国普通微生物菌种保藏中心提供，菌种保藏编号1.6859。

所述步骤（1）中，培养基为平面或斜面培养基，采用葡萄糖10～20g/L，马铃薯浸出液180～220g/L，甘油5～10g/L，琼脂20g/L，PH自然，培养温度30～37℃，时间3天。

所述步骤（2）中，将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释100倍至菌液中菌体浓度为每毫升含10⁷个细胞，然后用微量移液器取该菌悬液均匀涂布于无菌平皿上。

所述步骤（2）中的N⁺或Ar⁺离子注入能量为10～60kev，剂量为1.3×10¹⁵～3.9×10¹⁵N⁺/cm²。

所述初筛平板培养基中添加30～150mg/L的维生素K2类似物，培养温度30～37℃，时间3天，所述维生素K2类似物选自2-甲基-1，4-萘醌、1,4-二羟基-2-萘甲酸、1-羟基-2-萘甲酸中的一种。