[发明专利]重组表达载体pEGFP-DsRed-BP及其在检测哺乳动物细胞内ΦC31整合酶活性中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程和蛋白活性检测技术领域，具体涉及重组表达载体pEGFP-DsRed-BP及其在检测哺乳动物细胞内φC31整合酶活性中的应用。

背景技术

来源于链霉菌噬菌体的φC31整合酶能够特异性地催化噬菌体基因组与宿主基因组之间的重组反应。在该重组反应中，φC31整合酶能够识别并介导attB（最小34bp）和attP（最小39bp）DNA片段之间的重组（Groth A C,Olivares E C,Thyagarajan B,et al.A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,11:5995-6000），重组后产生杂合的attL和attR，而这两个新杂合位点不能被φC31整合酶再次识别，因此该重组反应具有单向性的特点。不仅如此，该重组反应还不需要任何能量和辅助因子，因此，φC31整合酶已经成为目前的一种有力的基因修饰工具，在基因治疗和转基因动物生产中均具有很大的应用价值。

然而，该整合酶系统目前还存在一些缺陷和不足，如该酶的作用效率和特异性是细胞类型特异的，在某些细胞类型中，其作用效率非常低。目前一些研究人员正试图筛选出一些活性更高的整合酶突变体。因此如何设计一种简便并且在各种细胞内均能有效检测φC31整合酶活性的方法，对促进该酶在不同细胞类型中的应用以及筛选整合酶活性更高的突变体都具有重要的意义。

在目前的细胞内φC31整合酶活性检测方法中，其检测指标主要是依据表达GFP细胞的比例以及荧光素酶或者β-半乳糖苷酶的表达量等来检测酶的活性(Keravala A,Lee S,Thyagarajan B,et al.Mutational derivatives of phiC31integrase with increased efficiency and specificity.The American Society of Gene Therapy,2009,1:112-120.Maucksch C,Aneja M K,Hennen E,et al.Cell type differences in activity of the Streptomyces bacteriophageφC31integrase.Nucleic Acids Research,2008,17:5462-5471)。但前者的检测指标很容易受到转染效率的影响，后者的检测指标均需要专业而且价格昂贵的试剂检测盒才能释放荧光信号，检测成本较高。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种重组表达载体pEGFP-DsRed-BP，其包含载体骨架pEGFP-C1、反向互补插入的DsRed基因序列、φC31整合酶识别序列attB以及反向互补插入的attP序列。

在一个优选的实施方案中，上述重组表达载体pEGFP-DsRed-BP是通过以下步骤制备而来的：

1、依据φC31整合酶特异性催化DNA重组反应的机制和特点，分别合成能够被该酶识别的attB序列和attP反向互补序列。

2、从pDsRed-monomer-N1载体中克隆全长的DsRed-monomer基因（包含完整Kozak序列）。

3、以pEGFP-C1载体为骨架，将attB序列插入到其中的Nhe Ⅰ和Age Ⅰ两酶切位点之间，将attP反向互补序列插入到Pst Ⅰ和BamH Ⅰ两酶切位点之间，将DsRed-monomer基因的反向互补序列插入到Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两酶切位点之间，构建成pEGFP-DsRed-BP载体。

本发明另一方面提供了一种制备重组表达载体pEGFP-DsRed-BP的方法，其包括如下步骤：

1、依据φC31整合酶特异性催化DNA重组反应的机制和特点，分别合成能够被该酶识别的attB序列和attP反向互补序列。

2、从pDsRed-monomer-N1载体中克隆全长的DsRed-monomer基因（包含完整Kozak序列）。

3、以pEGFP-C1载体为骨架，将attB序列插入到其中的Nhe Ⅰ和Age Ⅰ两酶切位点之间，将attP反向互补序列插入到Pst Ⅰ和BamH Ⅰ两酶切位点之间，将DsRed-monomer基因的反向互补序列插入到Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两酶切位点之间，构建成pEGFP-DsRed-BP载体。