[发明专利]测定微生物制剂降低烟叶中蛋白质含量的作用因子的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种探测微生物制剂降低烟叶中蛋白质含量的作用因子的方法。

背景技术

烟叶作为烟草的主要产物，其不仅作为模式植物成为重要研究对象，也是工业的主要原料。在我国，上部烟叶蛋白质含量偏高。蛋白质是烟草的重要化学成分，其含量高低不仅对烟草的生长过程十分重要而且与烟草品质密切相关微生物在烟叶生长、调制、醇化、加工和贮存期间起着非常重要的作用。近年来，微生物被广泛用于改善烟叶中的化学成分以提高烟叶品质。汪长国等人将从烟田附近的土壤中筛选的微生物喷施烟叶后能使烟叶中蛋白质含量降低和重要香味成分增加，进而提高烟叶品质【烟草科技，2006年第4期（总第225期），31-34】。但对微生物如何从分子水平改善烟叶品质的作用因子尚未研究清楚。

分析蛋白质含量的方法主要采用定氮法、双缩尿法、Folin－酚试剂法和紫外吸收法。但这些传统方法不能解释烟叶在喷施微生物后蛋白质降低的机理，不能找到降低烟叶中蛋白质的作用因子。

确定了微生物制剂中降低烟叶中蛋白质含量的作用因子，将有助于生产相关生物制剂，实现产品工业化、规模化，有利于提高烟叶质量。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种可准确探测微生物制剂中降低烟叶中蛋白质含量的作用因子的方法。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种测定降低烟叶中蛋白质含量的作用因子的方法，其测定步骤如下：

a）将分离筛选的微生物接种培养基，振荡培养后取菌液离心，将上清液过滤，得到代谢产物；

b）对微生物的代谢产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或双向电泳，再切取胶带或挖点酶解；

c）对胶带或胶点进行液相色谱串联质谱法分析；

d）对性质相同的不同烟叶分别用微生物制剂上清液、微生物制剂菌体、微生物制剂菌液和水进行处理，

e）对上述经过处理的烟叶进行芯片杂交，测定与植物防御应答、激素代谢、细胞周期调控和酶调控有关的基因上调表达和基因下调表达。

进一步地，步骤e）的具体步骤如下：

I芯片设计

利用烟草4×44K芯片，根据烟草cDNA序列设计，探针长度为60-mer；

II提取四种不同处理烟叶的RNA

（1）取不同处理的烟叶样品，取材后放入液氮中保存备用；

（2）取出各样品分别放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮后快速磨成粉末状，转移至1.5mL无RNase的离心管中；

（3）每0.1g组织样品，加入1000μL Trizol，充分摇匀，室温放置10min，Trizol为总RNA提取试剂；

（4）12000rpm，4℃，离心10min，取上清液至1.5mL离心管；

（5）加氯仿200μL，轻轻摇匀，静置5min；

（6）10000rpm，4℃，离心10min后，取上清液至1.5mL离心管；

（7）加异丙醇800μL，轻轻摇匀，静置10min；

（8）12000rpm，4℃，离心10min；弃上清液，加75﹪乙醇1000μL，并将沉淀弹起来；

（9）10000rpm，4℃，离心5min；弃上清液，加75﹪乙醇1000μL；

（10）10000rpm，4℃，离心5min；弃上清液，放置大约1h使其干燥；

（11）用100μL DEPC处理过的水溶解RNA并电泳检测；

III RNA的检测

首先电泳检测RNA的完整性，然后用紫外分光光度计检测纯度和浓度，步骤如下：

（1）凝胶制备

称取0.48g琼脂糖于25mL ddH₂O中，加热溶解，冷却至60℃，依次加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液8mL和甲醛溶液7mL，室温下放置30min，制成40mL、浓度为1.2%的凝胶；

（2）电泳样品制备

在0.5mL离心管中加入以下溶液：总RNA5μL、甲酰胺10μL、甲醛3.5μL和5×甲醛凝胶电泳缓冲液2μL；将混合液置于65℃温浴15min后，冰浴2min；瞬时离心使管中溶液全部集中于管底，加入2μL灭菌的经过DEPC处理的甲醛凝胶电泳上样缓冲液，混匀；

（3）电泳

取2μL样品点样，用1×甲醛凝胶电泳缓冲液电泳；

IV RNA纯化

RNA纯化是在RNA电泳条带没有降解的条件下进行的，具体是使用RNeasy mini spin column试剂盒对RNA进行纯化；