[发明专利]一种产磷脂酶C的重组大肠杆菌及制备磷脂酶C的方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种产磷脂酶C的大肠杆菌，同时还涉及一种产磷脂酶C的大肠杆菌的制备方法以及该工程菌发酵生产的磷脂酶C在植物油脂脱胶等方面的应用。 

背景技术

磷脂酶C(PLC，:EC3.1.4.3)是专一水解天然磷脂Sn-3位磷脂酰酯键的水解酶，在生物的生命活动中起着第二信使的作用，广泛分布于细菌、酵母菌、粘菌、果蝇、蛙及各种哺乳动物体中，可应用于医药、饲料改良和食品工业领域。医药方面，用于研制抗血小板聚集药物，预防血栓形成和心脑血管疾病。在饲料改良方面，磷脂酶添加于饲料中水解磷脂，改善饲料的利用效率和促进动物生长。在食品工业方面，PLC可被应用于油脂脱胶；同时由于磷脂酶可使面团形成胶状复合体，减少淀粉回生，应用于烘焙行业。 

近年来，随着PLC在食品、医药、饲料等领域的广泛应用，国内外学者对其进行了大量的研究。与其他来源的PLC相比，微生物具有生长繁殖快、培养周期短、产酶量高等特点。 

国内对磷脂酶C的研究虽起步较晚，但也取得了一定成果，例如：2005年陈涛等人对筛选到的产PLC菌株Bacillus cereus Shenzhen754-1进行三次紫外线和两次Co60-γ射线诱变处理，筛选出三株高PLC活性的诱变株，酶活分别达到14.878、16.450、16.400U/ml(陈涛，王常高，刘晓辉，何东平.高产磷脂酶C菌株的诱变选育.天然产物研究与开发，2005，17(6)：712-716.)；2007年高林对Bacillus cereus Shenzhen754-1进行培养条件的优化，将酶活提高至26U/mL(高林.磷脂酶C高产菌株的筛选、鉴定和培养条件的优化研究.安徽农业大学的硕士学位论文，2007)；2010年詹逸舒筛选到一株Bacillus cereus Z-13，用卵黄琼脂杯碟法测定该菌株所产生的PLC的沉淀圈(乳白色沉淀圈)，其直径可达30mm，酶活达到23.31U/ml(詹逸舒.产磷脂酶C菌株的筛选及其酶学性质的研究.湖南农业大学的硕士学位论文，2010)。 

与动植物来源的PLC相比，上述微生物来源的PLC具有更短的生产周期，但仍存在如下弊端：如野生菌株分离纯化耗资大，大多数具有潜在病原性，在食品安全性方面存在一定隐患；基因工程菌株其构建和产酶工艺较为复杂， 产酶量还有待提高。 

在植物油脂精炼中，需要将毛油中的磷脂除去(即脱胶)，如果不进行脱胶，油脂在加热到一定温度时就会发黑并产生黑烟，传统的脱胶工艺是采用碱化学的方法，即在毛油中加入NaOH，把磷脂转化成脂肪酸钠，在通过离心除去，此法油脂损耗和能耗较大、且产生的废水和皂角污染环境。而将磷脂酶C应用于植物油脂精炼，利用磷脂酶C将油脂中的磷脂转化成易于溶解在水中的磷酸酯和溶于油中的甘油二酯，再经过离心即可除去油脂中的磷酸脂，达到脱胶的目的，不产生含碱废水和皂角。酶法脱胶技术以其良好的经济效益、卓越的环保优势和简单的生产工艺已成为油脂精炼工艺的发展趋势。 

酶法脱胶工艺也随着磷脂酶制剂研究的不断深入而得到越来越广泛的应用，酶法脱胶技术相继在美国邦吉公司、德国邦吉曼海姆公司等油脂企业进行工业化应用。南海油脂工业有限公司是国内首个进行酶法脱胶工艺中试研究的企业。华南理工大学和诺维信公司进行合作，用酶法脱胶进行大量实验，结果证明酶法脱胶对不同质量的毛油具有相当强的适应性，对大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、米糠油等都适用。 

发明内容

鉴于上述和/或现有酶基因工程和酶工程领域中存在的问题，提出了本发明。 

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一株产磷脂酶C的重组大肠杆菌及用其制备磷脂酶C的方法。利用该菌株通过液体发酵来生产磷脂酶C，产酶量和酶活性高，安全性好，制酶工艺简单，成本低。 

本发明还有一个目的是在于提供了一种产磷脂酶C的大肠杆菌在植物油脂(大豆油、菜籽油、米糠油等)脱胶中的应用。利用大肠杆菌发酵产生的磷脂酶C与卵磷脂(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)发生反应，生成甘油二酯和水溶性磷酸酯，从而减少最终工序中的乳化情况。这样在离心分离过程中可以将胶质分离得更干净，同时也减少了中性油的损失。此外，磷脂酶C脱胶过程中生成的甘油二酯（DG）也是一种意外收获的油产物，在整个精炼工艺过程中都始终存在。水溶性磷酸酯经水化脱胶很容易除去，使油脂中的磷含量≤10ppm(相当于磷脂含量低于0.26‰)。与现有的化学法相比，具有环保、节能、出油率高的优点。 

本发明的技术方案如下：