[发明专利]一种重组大肠杆菌及制备磷脂酶C的方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于单核细胞增多性李斯特菌的磷脂酶C的生产方法及其在油脂脱胶工业方面的应用，属于酶基因工程和酶工程领域。 

背景技术

单核细胞增多性李斯特菌（L.monocytogenes），是一种重要的食源性致病菌，生长温度范围为-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃。单增李斯特氏菌为典型的耐冷性细菌能在普通冰箱的冷藏室生长繁殖，﹣20℃低温仍可部分存活，且含有单增李斯特菌的食品冷藏时间越长，其危险性越大；且具较强耐热能力，牛奶巴氏消毒温度不能将其杀死。兼性厌氧，常在含有CO2的微需氧环境中生长；对营养要求不高，能在物体表面形成生物膜对抗菌物质有抵抗作用，还可耐酸，可抵抗反复冻溶，抗干燥，具有耐盐性。单增李斯特氏菌可以在野生动物、家畜、鸟类、昆虫、污水、土壤和植物中生长，因此，常能在牛、羊、家禽中检测到单增李斯特氏菌，乳制品、水果、蔬菜、熟肉制品、海产品中也常有不同程度的污染。临床显示，感染李斯特氏菌病包括流产、败血症、脑膜炎等，症状类似流感，并且常伴有发热肠胃炎综合征。 

单增李斯特氏菌可产生两种磷脂酶C（PLC）：磷脂酰肌醇磷脂酶(phosphatidylinositol phospholipaseC,PI-PLC)和磷脂酰胆碱磷脂酶C(phosphatidylcholin phospholipase C,PC-PLC)。前者由plcA基因编码，后者由plcB基因编码。plcA基因和plcB基因均是与单增李斯特氏菌胞内寄生生命周期有关的毒力岛1(LIPI-1)的重要基因成分。 

PLC主要作用于甘油磷脂C3位上甘油磷酸酯键，水解产物为甘油二酯（DAG）及磷脂酸化合物（磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸以及磷酸肌醇等），在医药行业一直具有重要应用。而目前因水解产物DAG可与甘油三酯（TAG）共同成为油的一个成分不需被除去，而引起油脂行业的关注，被越来越多的作为一种新兴的酶法脱胶用磷脂酶在油脂脱胶工艺中使用。PLC酶法脱胶具有适用性广，反应条件温和，生产中节省酸碱化学品的消耗，几乎不产生皂脚和废水等，经济效益明显增长等一般酶法脱胶的共同优点，但相较于其他的酶法脱胶，如磷脂酶A（PLA）酶法脱胶，PLC酶法脱胶不仅能大大缩短脱胶时间，还能够有效提高毛油得率，降低毛油损耗，通常每500ppm磷就可以 提高约1%的油产量，这一特点在粮食价格持续上涨的今天显得尤为重要。 

国外对脱胶用磷脂酶C的研究起步较早。1988年，Graille等提出用PLC处理油脂，将磷脂转化成DAG，不仅不会将TAG成分带走，还能产生部分“油”，减少油脂在精炼过程中的损失。Graille等还进一步研究利用蜡状芽孢杆菌制备PLC酶制剂，但由于当时制备成本的限制，忽视了PLC潜在的商业价值。2005年，S.格拉马蒂科瓦用Mut+表型的毕赤酵母菌株表达异源PLC，用于处理油脂，可将毛油中的磷脂残留量降低至10ppm以下。但鉴于大多数PLC属于磷脂酰胆碱专一性磷脂酶C（PC-PLC），对磷脂酶胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）具有较高的特异性，而对磷脂酰肌醇（PI）活性较低，只用PC-PLC脱胶不能完全除去毛油中的磷，因此Gramatikova在2005年首次提出将PLC和PLA联合使用进行油脂脱胶。2006年，长崎咏子等利用溜曲霉IAM13907株和米曲霉NBRC4190株纯化得到一种新型PLC，相对分子量约为87kDa，在0-80℃范围内较稳定，被广泛用于食品和化妆品行业。2007年，Verenium公司在AOCS年会上推出了（PLC），已经成为目前工艺最成熟的脱胶用PLC产品。PLC（BD16449）是Vince Ciofalo利用毕赤酵母SMD1168重组表达的一种分子量约为34kDa的糖基化蛋白酶，安全性高，被应用于植物油脱胶。2008年，C.L.g.戴顿等在Gramatikova的研究基础上，综合考虑PLA和PLC的优缺点，发明了PC-PLC/PI-PLC与PLA1/PLA2的混合制剂，用以去除植物油中的磷脂。研究表明，复合制剂的酶促反应速度明显优于单独使用，可以讲残磷含量降至3ppm以下，从而避免了其他辅助脱胶工序，节省了大量的化学试剂和水。Danisco也通过（LAT）和PLC的复合制剂对胶质进行处理，显著减少了毛油的炼耗率。