[发明专利]一种低分子量胶原蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过前处理、分子筛层析及离子交换柱分离而获得低分子量的胶原蛋白的制备方法。 

背景技术

胶原蛋白是保健产品中重要的功能因子，拟对目前影响胶原蛋白质量的主要因素进行探索性试验。影响胶原蛋白功效的主要因素为来源、工艺和分子量，其中分子量的分布又与工艺直接相关。相对分子量是水解胶原蛋白质量的重要指标，需对其进行深入研究，确定水解胶原蛋白的相对分子量与活性的关系。另现有的功能文献表明不同的氨基酸组成和分子量的产品有不同的美容功效，而这些需通过工艺和复合技术达到全面的美容功效。因此拟对胶原蛋白的工艺条件进行研究，以不同来源鱼皮为原料，对原料的的前处理、酶解工艺和酶解液的分离手段进行研究。 

发明内容

来源于鱼皮如鳕鱼皮、罗非鱼皮等下脚料，通过鱼皮杂蛋白的去除、鱼皮脂肪的去除、鱼皮胶原蛋白的酶解、样品胶原蛋白酶解多肽液的分子筛层析分离纯化、离子交换层析分离纯化，获得高纯度的不同范围分子量的胶原蛋白样品。 

1.根据本发明，鱼皮胶原蛋白的提取的步骤为： 

(1)鱼皮杂蛋白即非胶原蛋白的去除：称取若干鱼皮粉按1∶10～50(g/ml)加入0.01～1M的NaOH在0～30摄氏度下浸泡2～48h，用双蒸水反复浸洗直至中性，滤干。称重。 

(2)鱼皮脂肪的去除：经上述处理的鱼皮粉按1∶10～50(g/ml)加入1～50％正丁醇在0～30摄氏度下浸泡2～48h，用双蒸水反复浸洗直至中性，滤干。称重。 

(3)鱼皮胶原蛋白的提取：经过上述处理的鱼皮按0.1％-15％的比例加入木瓜蛋白酶(pH最佳是7左右)，37摄氏度(是木瓜蛋白酶的最佳活性温度)水浴4-12h，每30min搅拌一次。倒入事先称重的滤纸，完全滤干，称重，计算鱼皮溶解率。 

2.根据本发明，上述鱼皮胶原蛋白酶解多肽液的分子筛层析分离纯化步骤为： 

(1)凝胶的选择：本发明根据鱼皮胶原蛋白层析物质分子量的大小选择G-25葡聚糖凝胶 

(2)凝胶的预处理：本发明选择称取10-1kg的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱(或室温)中充分膨胀0.5-2天，为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次。 

(3)装柱：本发明层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。 

(4)加样与洗脱：本发明的样品经过0.25-0.45um滤头过滤，上样体积为每次1-5ml，流速0.5-2.5ml/min，用超纯水洗脱。测定收集样品的浓度。 

3.根据本发明，上述分子筛层析后的样品进行离子交换层析分离纯化实验的步骤为： 

本发明的操作流程如下： 

填料DEAE预处理→湿法装柱→平衡色谱柱→柱头上样→梯度洗脱→收集洗脱峰→检测峰蛋白浓度 

(1)本发明填料DEAE的预处理步骤为： 

称取一定量的DEAE纤维素粉，用蒸馏水浸泡2～4h，进行浮选，倒去上层水相后，加入蒸馏水洗净，用真空泵抽干后，用0.1-2mol/L HCl溶液浸泡洗涤0.5-3h，抽干，用大量蒸馏水洗涤至接近中性。再用0.1-2mol/L NaOH溶液浸泡洗涤0.5-3h，抽干，同样用大量蒸馏水洗涤至接近中性。然而再用0.1-2mol/LHCl溶液浸泡，进行改型，抽干，蒸馏水洗涤至接近中性。最后用含1-5mol/L尿素的0.02mol/LNaAC-HAC缓冲溶液洗涤数次，洗至恒定pH，浸泡在含1-5mol/L，尿素的0.02mol/L NaAC-HAC缓冲液中。最好每次洗脱后都要进行该步处理。 

(2)本发明装柱、平衡的步骤为： 

选择16mm×200mm玻璃层析柱，洗净，垂直安装在铁架台上，关闭柱出口。向柱中加入含1-5mol/L尿素的0.02mol/L醋酸钠-醋酸缓冲溶液约5cm柱高(注意柱的下端必须充满液体，不得有气泡)。打开柱出口，从柱的上面不断缓慢的加入已处理好的DEAE纤维素溶液，控制流速在0.5～2.0mL/min，直至距离柱的上端约8cm。接上装有1-5mol/L尿素的0.02mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液的洗脱瓶，平衡2h-10h。关闭柱出口，用滴管吸走上端的缓冲液，留下一层约2mm缓冲液铺盖DEAE柱床表面。接上AKTA的系统，用注射器或者直接进样口进样。 

(3)本发明的洗脱步骤为：