[发明专利]一种微囊化大肠杆菌口服灭活疫苗的优化制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微胶囊口服灭活疫苗的制备，通过正交试验对壁材浓度、芯壁比、乳化剂含量、进出风温度、均质速度和进样速率进行优化，并以包埋率、平均粒径和免疫效果进行评估，保证产品的质量。 

背景技术

目前微胶囊技术应用十分广泛，通过微囊化可以改善被包裹物质的物理性质（颜色、外观、表观密度、溶解性），使被包裹物质免受环境因素的影响，提高被包裹该物质的稳定性，改善其反应活性、耐久性、热敏性、光敏性和压敏性等特性，减少有毒物质对环境造成的不利影响，屏蔽不良气味，降低物质毒性，根据需要持续释放物质进入外界环境等。微胶囊的制备技术起源于20世纪30年代，50年代末到60年代初人们开始把合成高分子的聚合方法用于微胶囊技术的研究，70年代微胶囊技术的工艺日臻成熟，应运领域不断扩大，80年代后微胶囊技术的研究不仅发表了许多微胶囊合成技术的新专利，而且开发出纳米胶囊。微胶囊技术凭借其具有提高疫苗稳定性、生物相容性以及赋予疫苗靶向性及缓释性等一系列优越的性能，在兽用疫苗领域得到了越来越广泛的应用。应用口服疫苗通过饮水或采食对动物进行预防接种，与传统的注射给药途经相比可减少因注射不当引起的感染，减轻注射对人和动物造成的不适感，具有安全易行、实用方便、省时省力等优点，而且口服疫苗免疫后可刺激胃肠道粘膜产生sIgA抵御有害微生物和毒素对机体的损害，但直接口服灭活疫苗后由于消化道内的酸碱环境变化和各种酶的作用，疫苗极易丧失活性。 

本发明研制的微胶囊产品，将微胶囊化技术与口服给药方式结合，更具有缓释和靶向效果的口服疫苗，使其可以抵御胃酸和酶的破坏，到达指定部位吸收，从而提高吸收效率，达到理想的免疫效果。本工艺改变传统大肠杆菌疫苗注射剂型，采用微囊包被技术制备新型口服制剂，使大肠杆菌疫苗的免疫接种途径更加简单方便，具体有重要的应用价值。 

发明内容

本发明目的在于：采用微囊包被技术制备的新型口服制剂，使大肠杆菌疫苗的免疫接种途径更加简单方便，提供反刍动物用大肠杆菌口服疫苗。 

本发明的目的是这样实现的：一种微囊化大肠杆菌口服灭活疫苗的优化制备方法，分步骤实施; 

步骤1芯材的制备： 

1)取冻干菌种，接种于灭菌的普通肉汤内，37℃培养20h，取此菌液，注射于实验小白鼠的腹腔内，待其死亡后，无菌剖取肝脏进行匀浆，涂布于麦康凯培养基上，37℃培养24h，用10%脱纤维蛋白的绵羊鲜血琼脂平板继续划线分纯至2代，经革兰氏染色、镜检、纯化后，挑取光滑圆整菌落，接种于鲜血琼脂斜面，作为一级种子菌，此时再将其接种于普通肉汤内，37℃培养20h，纯粹检验合格后，作为二级种子，4℃保存备用； 

2）取二级种子菌液接种于营养琼脂平皿，置于37℃恒温培养箱培养24h，用含5‰甲醛的灭菌0.85%生理盐水冲洗菌苔，收集菌液，先低速3000rpm离心去除培养基等杂质，再高速10000rpm，离心收集菌体，反复离心三次，用麦氏比浊法调整菌液浓度至200亿菌/ml，置37℃温箱灭活48h，期间振荡数次，得灭活菌液，检验合格，进行配苗； 

3）取灭活好的灭活菌液与含蜂胶30mg/ml的乙醇提取液等体积混合，低速3000rpm搅拌均匀，制成褐色菌苗悬液，即得灭活抗原组织，4℃保存； 

步骤2微囊包被的主要影响因素试验： 

设海藻酸钠浓度、芯壁比、乳化剂含量、进风温度、均质速度的不同梯度，以包埋率为主要评价指标，粒直径大小为辅助指标，进行单因素试验； 

1）在固定芯壁比为1:1、乳化剂含量为0.5%、进风温度200℃、出风温度80℃、进样速率55ml/h、10000rpm均质15min的条件下，改变海藻酸钠浓度为1%、2%、3%、4%、5%，测定其包埋率，获得最佳壁材浓度，即海藻酸钠浓度为1%-3%。 

2）在固定海藻酸钠浓度为2%、乳化剂含量为0.5%、进风温度200℃、出风温度80℃、进样速率55ml/h、10000rpm均质15min的条件下，改变芯壁比为1:1、1:2、1:3、1:5、1:8、1:10，测定其包埋率，获得最佳芯壁比为：1:1-1:5。 

3）在固定海藻酸钠浓度为2%、进风温度200℃、出风温度80℃、进样速率55ml/h、10000rpm均质15min的条件下，改变乳化剂含量0.5%、1%、1.5%、2%、4%、6%，测定其包埋率，获得最佳乳化剂含量乳化剂含量为：5-7%。