[发明专利]一种染料亲和磁性微球的制备及用于乳清中乳铁蛋白分离的应用

权利要求书

1.一种染料亲和磁性微球的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：

步骤一，磁核材料制备：

A）利用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子，各试剂的质量比配方为：FeCl₃·6H₂O：FeCl₂·4H₂O：H₂O=2.3751：0.8735：250；

B）称取FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O，溶解于去离子水中，于500rpm搅拌速率下搅拌至透明；

C）通入氮气（N₂）10～15min以排除空气；

D）滴加氨水调pH>10，搅拌10min，80℃水浴保温30min，得到沉淀物；

E）将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次，得到Fe₃O₄纳米粒子；

步骤二，磁核表面壳聚糖修饰：

A）将步骤一制备的Fe₃O₄纳米粒子1g加入盛有200mL石蜡和10mLSpan–80的烧杯中，搅拌均匀；

B）称取1.5g壳聚糖，溶解于50mL质量浓度为5%的醋酸水溶液中；

C）将两种液体混合，并于800rpm的搅拌速率下搅拌30min；

D）加入2.5mL25%戊二醛，并于800rpm继续搅拌30min；

E）加入2.5mL25%戊二醛，并于800rpm再搅拌2h，60℃水浴中保温2h；

F）去除上清液后的沉淀物用石油醚、丙酮、无水乙醇清洗，在40℃烘箱中干燥24h，即得磁性壳聚糖微球。

步骤三，磁性壳聚糖微球的表面功能化：

A）取步骤二得到的磁性壳聚糖微球2g，加入到200mL浓度为2mg/mL的活性红120溶液中，60℃水浴搅拌30min；

B）加入10mL浓度3.4mol/L的NaCl溶液，继续搅拌30min；

C）加入4mL浓度2.4mol/L的Na₂CO₃溶液，在80℃反应4h；

D）反应结束后，将得到的磁性壳聚糖微球分别用50℃～60℃的温水、甲醇、2mol/L的NaCl，6mol/L的尿素和蒸馏水洗涤，即得活性红120功能化了的磁性亲和微球。

2.权利要求1所述方法得到的活性红120功能化了的磁性亲和微球用于乳清中的乳铁蛋白分离应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，按照以下步骤操作：

将活性红120功能化了的磁性亲和微球，按100mg磁性亲和微球：30mL乳清的比例加入乳清中；在200r/min摇床上震荡1h，进行乳铁蛋白吸附操作，于4℃、10000r/min离心15min，去上清液，收集表面吸附有乳铁蛋白的磁性亲和微球；用0.02mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液洗涤3次；加入pH7.0的1mol/L NaCl于200r/min摇床上振荡0.5h，进行洗脱操作；用永磁铁收集磁性亲和微球；洗脱液即为经过磁性亲和微球分离所得的乳铁蛋白溶液；

洗脱液用质量分数为12%的分离胶和质量分数为4%的浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，分析获得的乳铁蛋白的纯度。