[发明专利]一株产L-赖氨酸的菌株及其生产L-赖氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株产L-赖氨酸的菌株及其生产L-赖氨酸的方法。

背景技术

L-赖氨酸（L-Lysine，Lys）是生物体维持生命活动的必需氨基酸之一，是世界上仅次于味精的第二大氨基酸品种，也是生物基尼龙等新型材料的重要前体。L-赖氨酸的生产方法包括抽提法、化学合成/酶法和微生物发酵法。传统的抽提工艺虽工艺简单，但动物血粉等原料来源有限，仅限于小规模生产；合成法生产赖氨酸过程需要使用剧毒原料光气，且可能残留催化剂，产品安全性差，环保问题严重；化学合成的DL-赖氨酸还需要经过酶法拆分或转化才能得到L-赖氨酸，大幅度提高了生产成本；微生物发酵法是目前工业生产赖氨酸的最重要方法，发酵原料广泛易得且价格便宜，如淀粉（木薯淀粉、玉米淀粉等）、糖蜜（甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等）。

微生物发酵法是利用营养缺陷型菌株，通过代谢控制发酵，人为地改变和控制微生物的代谢途径来实现L-赖氨酸的生产。生物合成赖氨酸的途径有两种：一种是通过2-氨基己二酸途径（如酵母菌、链孢霉等），另一种是通过2,6-二氨基庚二酸途径（如细菌、蓝藻、高等植物等）。前者的起始物是α-酮戊二酸，后者的起始底物为天冬氨酸。野生细菌细胞中的苏氨酸和蛋氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制作用，而赖氨酸对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶同时具有反馈抑制作用，从而限制了赖氨酸在细胞中的积累。1960年日本的木下祝郎、中山清等用紫外线照射谷氨酸捧杆菌得到一株高丝氨酸营养缺陷型变异株，使赖氨酸生产达到工业生产水平。US4066501公开了一种多重抗性短杆菌属和帮杆菌属菌株的筛选方法，其通过反复的α-氨基酸月桂酰胺（ALL）、γ-甲基-赖氨酸（ML）和N^ω-苄氧羰基-赖氨酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸（AEC）抗性筛选使得菌株L-赖氨酸产量提高50-60%。WO2009/014117通过基因工程途径修饰和降低了内消旋α-ε-二氨基庚二酸合成途径酶的活性，并导入编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因，获得了一种具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌。

离子束生物工程技术作为一种全新的诱变育种技术已广泛地应用于生物育种方面。低能氮离子作用于微生物时，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。此诱变技术已分别应用于谷氨酸、L-乳酸（CN 102653724 A）生产菌株选育，使得谷氨酸、L-乳酸分别提高35%、46%。

发明内容

本发明的第一目的是提供了一种能够简单、高效、安全生产L-赖氨酸的菌株。

本发明第二目的是提供一种上述菌株的获取方法。

本发明第三目的是提供一种利用上述菌株生产L-赖氨酸的方法。

为了实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下：

一种生产L-赖氨酸的菌株，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013239。

本发明菌株的形态学及生理生化特征如下：

菌落颜色：灰白色。

需氧方式：好氧生长。

菌落大小：0.3~0.8×1~4μm

适宜生长温度：34-40℃。

适宜生长pH：6.8-7.2。

菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。

革兰氏染色：阴性。

上述大肠杆菌NT1003△Met△Thr的获取方法，是以E. coli A301为出发菌株，通过紫外-氯化锂复合诱变，低能离子注入诱变，初、复筛而得到。

具体地说，所述大肠杆菌NT1003△Met△Thr的获取方法包括如下步骤：

1）菌悬液制备

E. coli A301与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，细菌浓度为10⁶个/mL； 

2）紫外-氯化锂复合诱变

将步骤1）的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在搅拌速率100-150 rpm下，进行紫外照射诱变，后取菌悬液涂布于添加氯化锂的LB平板培养基中，在34-40 ℃下避光倒置培养1-2 d；

3）低能离子注入诱变

将步骤2）中培养后的菌株洗涤，并制成菌悬液涂布于无菌空平皿上，吹干后，进行氮离子注入，后洗脱 、涂布到LB平板培养基上，在34-40℃下避光倒置培养1-2 d；