[发明专利]一种利用活性炭对L‑羟脯氨酸发酵液脱色的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用活性炭对L-羟脯氨酸发酵液脱色的方法，适用于发酵法制备L-羟脯氨酸的脱色过程。

背景技术

L-羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为手性分子，不属于20种常见氨基酸，共有4种同分异构体。本实验所用羟脯氨酸为反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-Proline)。L-羟脯氨酸的分布很广，是胶原、明胶、植物细胞壁蛋白质和微生物次生代谢产物的重要组成成分。近些年来L-羟脯氨酸在食品、医药、化妆品等方面发挥了不可替代的作用，可以作为婴幼儿食品和一些非哺乳动物的饲料添加剂，还起到调节脂肪乳化、抗肿瘤、抗高血压等作用，另外在化妆品方面也可以作为添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用。

发酵液中的色素主要有三种来源：原料自身所带有的色素、发酵过程中微生物代谢生成的色素和发酵液中残糖与某些氮源类物质反应生成的色素。色素又可分为三种类型：离子型、极性和非极性。在整个发酵过程中，发酵液一般呈酸性状态，在酸性环境中色素多为酸性离子型。活性炭的吸附作用主要是非特异性的，但是某些环境条件的改变有利于活性炭吸附发酵液中的色素，从而达到去除色素的目的。目前L-羟脯氨酸的生产主要是水解明胶法和发酵法，但是无论哪种生产L-羟脯氨酸的方法都伴有色素的产生，这些色素严重影响分离提取工作的顺利进行。

目前尚未有关于L-羟脯氨酸发酵液脱色的相关报道。利用活性炭对水解法生产的L-羟脯氨酸进行脱色的报道有：(沈金玉，张鹏飞.脯氨酸、羟脯氨酸脱色工艺研究.第九届全国生物化工学术会议，2000)。发酵法生产L-羟脯氨酸的报道有：利用大肠杆菌从4-羟基-2-酮戊二酸生产反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的方法(特开平3-266995)；利用霉菌直接发酵生产的方法(欧洲专利EP0547898A2)；利用链霉菌转化L-脯氨酸的方法(J.Biol.Chem，Journal of Biotogical Chemistry，254，6684-6690，1979、Biochem.Biophys and Res，Biochemical and Biophysical Research Communication，120，45-51，1984)。

发明内容

目前发酵法生产L-羟脯氨酸伴有大量色素产生，严重影响后续分离提取工作的顺利进行，而且目前尚未有公开发表的关于L-羟脯氨酸发酵液脱色的文章，产品又必须达到一定的透光率才符合生产标准，本发明要解决的问题是提供一种利用活性炭对L-羟脯氨酸发酵液进行脱色的方法。

本发明通过改变发酵液的性质及其外在环境，高效的利用活性炭的脱色能力，既将L-羟脯氨酸发酵液中的色素尽可能去除，又尽量减少对L-羟脯氨酸的吸附。为解决上述问题本发明所用技术方案如下：

一种利用活性炭对L-羟脯氨酸发酵液脱色的方法，该方法包括以下步骤：

(1)发酵液的预处理：L-羟脯氨酸发酵液于8000r/min高速台式冷冻离心机离心20min，除去菌体和固形物，取上清置于4℃层析柜中备用。

(2)活性炭的预处理：将粉末状活性炭用去离子水进行搅拌清洗，反复几次，静置至上清无明显杂质，然后弃去去离子水加入两倍体积的0.02mol/L盐酸，静置两小时，最后用去离子水洗至接近中性，于烘箱中烘干备用。

(3)L-羟脯氨酸发酵液的连续脱色：称取4.0g干燥的粉末状活性炭，装入层析柱中，用pH值为4左右的盐酸洗柱，确保活性炭中间无气泡，然后L-羟脯氨酸发酵液以1mL/min的流速上柱，脱色在室温下进行，根据中国药典中对氨基酸溶液透光率检测的规定，以去离子水为参照选用430nm为透光率测量波长，当流出发酵液透光率T₄₃₀低于97％时停止发酵液上柱。

(4)活性炭再生：先在层析柱中通入去离子水洗去未被脱色好的发酵液，此时洗出液可回收利用，然后通入经恒温水浴锅加热到70℃的氢氧化钠溶液，流速为0.5mL/min，至流出液以去离子水作参照透光率T₄₃₀大于99.9％为止，最后用去离子水洗涤再生后的活性炭，洗至接近中性。

(5)再生后的活性炭可以重复步骤(3)和(4)

步骤(1)中，所用发酵液为基因工程改造过的大肠杆菌发酵40h得到，L-羟脯氨酸含量12g/L左右，pH值为6.5左右，在波长为430nm处的吸光度为29.4。

步骤(2)中，所用活性炭单位重量表面积可达500～1000m²/g。