[发明专利]一个高产药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及将携带目的基因的植物表达载体转入发根农杆菌，然后再侵染硬紫草无菌苗而诱导出转基因的毛状根株系。 

背景技术

硬紫草(Lithospermum erythrorhizon sieb.et zucc)是我国一种重要的药用植物，其根部可合成紫红色的萘醌类药用天然产物——紫草宁及其衍生物(以下简称紫草宁)，这类物质具有抗菌、消炎、活血等功效，而且还是一种珍贵的天然色素，可以广泛用于食品、高级化妆品、日化产品与塑料制品的着色等^[1-3]。近年来国内外的研究还发现紫草宁通过活化Caspase-3和抑制拓扑异构酶活性来诱导癌细胞凋亡，被认为是继喜树碱、紫杉醇之后又一类极具潜力的天然抗菌消炎、抗肿瘤、抑制HIV病毒等多种药理活性的药物^[4-6]。 

我国紫草有新疆紫草、东北硬紫草、内蒙紫草、滇紫草、广西紫草等。近年来，随着环境的变化及人类的过度消耗，各种紫草资源正面临枯竭。如野生于东北长白山脉荒山坡地及内蒙古草原地带，因近十几年对荒山宜林地的开发利用及大量放牧，野生紫草资源日见减少，只有零星少量分布，目前东北野生紫草已无法大货供应市场。 

随着现代生物技术的发展，采用生物工程学手段生产人类所需的紫草宁，成为一种非常重要的替代手段。上世纪70年代，日本即已成功利用两阶段培养法，即在光照条件下B5固体培养基上繁殖紫草细胞，然后在黑暗条件下利用M9液体生产培养基中培养紫草细胞进行工业化生产紫草宁，紫草也从而成为世界上第一个采用细胞培养体系来商业化生产药用天然产物的药用植物^[7]。但在实践过程中发现，用细胞生产紫草宁存在诱导愈伤细胞困难、细胞易于老化褐化、紫草宁产量不高、产量不稳定、夏季不产紫草宁等诸多问题。 

发根农杆菌是在植物基因工程中广泛应用的一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，其携带的Ri质粒能有效侵染绝大多数双子叶植物，少数单子叶植物以及个别裸子植物，诱发植物产生形状如根系的发根即毛状根(hairy root)。由于发根农杆菌转化的毛状根具有生长速度快、分支多，能够持续合成次生代谢产物，获得的次生代谢产物量高且稳定、不需要添加外源植物激素等特点，因此可作为生产和研究植物次生代谢物质的生物反应器；同时，由于发根农杆菌携带的Ri质粒能将外源基因整合到寄主染色体、其诱导产生的毛状根易获得再生植株等优点，因此，建立特定植物的转基因毛状根体系，在定向分子育种方面具有广泛应用前景。近年来利用发根农杆菌已转化大约160多种植物，在40多种植物建立了毛状根培养体系，特别是一些药用植物建立了毛状根转基因体系，极大地方便了药用天然产物 生产及遗传育种研究。 

紫草宁的合成受到多种物理和化学因素的影响，如无机盐离子、光、乙烯和茉莉酸等^[8-10]。乙烯是一种能调控植物生长发育、抗逆境胁迫反应等多个方面的气态类激素，通过改变乙烯浓度，或者改变植物乙烯信号传导途径中关键基因的表达，可以改变植物天然产物的合成量，如改变烟草ERF189及ERF163表达，可直接促进烟草生物碱的合成^[11]；研究表明，乙烯同样是调控紫草宁合成的一种重要的物质^[12]。 

ACC合酶(ACC synthetase，ACS)能催化乙烯合成的前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，最终形成乙烯，是乙烯合成途径的关键限速酶。通过转基因技术将紫草本身的ACS基因转入紫草中过表达，从而获得高产药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系，在理论上是完全可行的。 

通过转基因技术获得高产药用天然产物的紫草毛状根株系，不仅在系统研究紫草药用天然产物生物合成途径及其分子调控机制方面具有重要的理论意义，并在商业化生产紫草药用天然产物方面具有非常重要的应用前景和价值。尽管目前国内外有利用紫草毛状根合成紫草宁的研究，但并无将紫草ACS基因转入发根农杆菌，诱导出能高效合成紫草药用天然产物的紫草转基因毛状根并提高紫草宁合成的相关报道。 

发明内容

本发明需要解决的问题是通过转基因技术获得一个高产药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系，主要是通过将所选择的目的基因(硬紫草ACC合酶基因LeACS-1)转入发根农杆菌，然后侵染硬紫草无菌苗，高效诱导出含目的基因的硬紫草毛状根，对获得的转基因毛状根扩大培养并进行分子鉴定和药用天然产物含量检测。 

本发明的技术方案包括如下步骤：