[发明专利]一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制法

说明书

技术领域

本发明属于纳米显像剂技术领域，具体涉及针对细胞凋亡的荧光增强成像的纳米显像剂及其制备方法。

背景技术

利用生物体系内荧光增强的现象来检测细胞凋亡状态的荧光纳米显像剂曾见于美国化学学会的杂志《美国化学学会会志》（J.Am.Chem.Soc.,2012,134,17972-17981）的报道，其应用了具有聚集诱导发射特性的荧光基团，将生物过程与聚集过程整合，但该显像剂在活体细胞凋亡状态的检测中需要的激发光波长在紫外区，这种波长的激发光本身对于细胞等生物体系是有害的。利用金纳米粒子具有良好荧光淬灭效应的特性设计合成的纳米显像剂在细胞凋亡检测中的应用研究见于美国化学学会的杂志《生物共轭化学》（Bioconjugate Chem.，2010,21,1939–1942）的报道，其中所使用的金纳米粒子可以商业购买，但对其进行修饰的过程及程度难于控制，修饰后金纳米粒子的稳定性受到影响，会呈现一定程度的下降，使得其在生物体系中的应用受到限制。

采用异硫氰酸荧光素异构体I作为荧光基团，（4-（4-（二甲基氨基）苯基）偶氮）苯甲酸作为淬灭基团，以可被半胱天冬酶3降解的寡肽片段（天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸）作为连接物的纳米荧光探针，用于检测细胞凋亡特定酶活性及活细胞凋亡状态方面的研究工作至今尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提出一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制备方法，以获得能够用于检测细胞凋亡特定酶活性及活细胞凋亡状态的荧光增强纳米显像剂，克服现有相关显像剂所需激发光波长过短及制备复杂、稳定性差的缺点，从而实现在活体细胞层面用于检测细胞凋亡特定酶活性及活细胞凋亡状态。

本发明的对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂的制备方法，其特征在于：

先合成一段寡肽序列，按：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸上的芴甲氧羰基，加入活化的第二个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第三个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第四个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去天冬氨酸上的芴甲氧羰基，加入活化的第五个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-缬氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去缬氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第六个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，最后加入活化的第七个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，最后用按三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：99的混合液40-50毫升从该树脂上切下合成的寡肽片段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，沉淀中乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基；

将上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基取0.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入0.12毫摩尔叔丁氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第一种中间产物L₁；

将上述制备的第一种中间产物L₁溶解在按三氟乙酸与二氯甲烷体积比为95：5的10毫升混合液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第二种中间产物L₂；