[发明专利]一种热稳定脂肪氧合酶突变体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种热稳定脂肪氧合酶，特别是一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

微生物脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX，EC1，13.11.12）属于氧化还原酶，是一类含非血红素铁的蛋白质，能专一催化具有顺，顺4-烯结构的多不饱和脂肪酸，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物，此物质是相当重要的化学和药物合成的中间体，同时能将其转化为酮，是食品风味物质醛与醇的前体物质。因此在食品领域有着广泛的应用前景。但脂肪氧合酶自身的一些缺陷如比酶活、热稳定性等因素，限制了脂肪氧合酶的应用范围。因此基于已得到的脂肪氧合酶在大肠杆菌中的表达平台，利用氨基酸缺失，对脂肪氧合酶进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的脂肪氧合酶。

已报道的P.aeruginosa LOX晶体结构在N端有两个特有的α-螺旋。同时，这两个α-螺旋形成“盖子”状结构覆盖在P.aeruginosa LOX底物结合区域上方。值得注意的是，这一“盖子”结构通过6个氨基酸(201-TQRGQG-206，简称为L6)组成的高柔性loop与C端催化结构域连接，并在催化过程中对底物结合口袋进行调节。高柔性loop往往是酶分子中对热不稳定、容易首先发生去折叠的部分。因此，降低L6所在区域的柔性有望有望提高LOX的热稳定性。但是，L6对“盖子”结构及底物结合通道具有一定的调节作用，其柔性对酶的催化活性可能也具有较大的影响。

为改善脂肪氧合酶热稳定性差的现状，本研究通过缺失、脯氨酸突变及PT linker替换对脂肪氧合酶的L6进行改造，从而使loop结构的柔性降低刚性增强，改变催化特性，提高热稳定性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种热稳定脂肪氧合酶突变体。

所述热稳定脂肪氧合酶突变体是在铜绿假单胞菌BBE（Pseudomonas aeruginosa BBE）脂肪氧合酶201-TQRGQG-206引入脯氨酸突变或进行PT linker替换得到。

所述P.aeruginosa BBE从中国典型培养物保藏中心获得，编号为CCTCC NO:M2011185。

所述脯氨酸突变是将G204、G206分别作为脯氨酸替换的突变位点，或者同时对G204和G206进行脯氨酸替换；编码所述突变体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

编码所述201-TQRGQG-206→PT linker替换得到的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述突变体的方法。

所述构建突变体的方法是通过PCR法向脂肪氧合酶201-TQRGQG-206中引入脯氨酸突变或进行PT linker替换。具体地，是以Pseudomonas aeruginosa BBE基因组为模版，克隆得到脂肪氧合酶基因lox，以含基因lox的质粒为模版，通过PCR法突变lox中编码201-TQRGQG-206的区域，将测序正确的基因连接表达载体转化E.coli Rosetta(DE3)获得产脂肪氧合酶突变体的基因工程菌。

含编码所述脂肪氧合酶突变体的DNA序列的基因工程菌或转基因细胞系亦是本发明要求保护的范围。

本发明以脂肪氧合酶在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对脂肪氧合酶成熟酶分子内部高柔性loop(L6)的改造，在未显著影响催化效率的基础上将酶的热稳定性提高了3.5倍，改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

附图说明

图1突变体G204P、G206P和G204/206P的分泌表达及纯化后的SDS-PAGE电泳分析；1-3：突变体的发酵上清液；1：G204P；2：G206P；3：G204/206P。4-6：纯化后的突变体；4：G204P；5：G206P；6：G204/206P。

图2突变体L6/PT的分泌表达及纯化后的SDS-PAGE电泳分析；1：突变体L6/PT的发酵上清液；2：纯化后的L6/PT。

具体实施方式

培养基：

LB培养基：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl10g/L、pH7.0。