[发明专利]分离纯化米曲霉转化子的方法

说明书

本发明涉及分离纯化米曲霉(Aspergillus oryzae)转化子的方法以及用米曲霉生产目标蛋白的方法。在所述方法中，在用传统的单孢分离来对转化子进行纯化的过程前，加上一步用含肌醇的培养基进行单核分离的过程，从而大大提高转化子分离纯化的效率，节约人力成本和时间成本。通过提高转化子分离纯化的效率，也大大提高了用米曲霉表达目标蛋白的效率。

技术领域

本发明涉及微生物的分离和纯化。具体涉及分离纯化米曲霉(Aspergillusoryzae)转化子的方法以及用米曲霉生产目标蛋白的方法。

背景技术

米曲霉(Aspergillus oryzae)为好气真菌，属曲霉属，半知菌亚门，具有高效的蛋白分泌表达能力，不产生黄曲霉毒素等有毒物质。

米曲霉生产酱油、豆面酱、清酒等许多发酵食品的历史可追溯到1000多年以前，被美国食品与药品管理局(FDA)列为GRAS(Generally Regards As Safe)级别并得到了世界卫生组织的认可(MachidaM.Progress of Aspergillus oryzae genomics.AdvApplMicrobio，l 2002，51：81，106)，是丝状真菌中应用非常普遍的种属，广泛应用于食品酿造行业、工业酶制剂行业。

米曲霉表达异源蛋白具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞等特点，且表达的外源蛋白具有天然活性。另外，米曲霉还能进行各种翻译后加工，如糖基化修饰蛋白酶切割和二硫键的形成等(Meyer V.Genetic engineeringof filamentous fungi-progress，obstacle and future trends.Biotechnol Adv，2008，26(2)：177-185)。因而，利用米曲霉作为一个表达菌株来表达同源和异源蛋白日益受到重视。

米曲霉的菌丝是多核有隔的，而绝大部分分生孢子也是多核的，所以使得诱变效率大打折扣，甚至会影响发酵过程的稳定性、遗传分类和工业菌株的繁殖(Jun-ichiMARUYAMA.，Visualization of Nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP andAnalysis of the Number of Nuclei in Each Conidium byFACS.Biosci.Biotechnol.Biochem，65(7)，1504-1510，2001；YUIKL，E.，The number ofnuclei in conidia of Aspergilli.Trans.Brit.Mycol.1950，Soc.33：324-331)。目前米曲霉转化最常用实验方法是原生质体法、根癌农杆菌介导法和电转化法等(MeyerV.Genetic engineering of filamentous fungi-progress，obstacle and futuretrends.Biotechnol Adv，2008，26(2)：177-185)。用原生质体法酶解菌丝而制备的原生质体是多核的；根癌农杆菌介导法、电转化法针对的米曲霉菌丝或孢子也是多核的。这样，每个核基因组由于发生转化事件的频率和位点不同而成为异核体菌株。因此，都需要对转化后获得的转化子进行分离纯化的工作，从而尽可能使米曲霉转化子保持纯核的状态，一来可以保持菌株的稳定性，再者也可以提高获得高酶活表现菌株的几率。