[发明专利]利用高分辨熔解曲线分析技术检测线粒体乙醛脱氢酶基因分型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种线粒体乙醛脱氢酶基因分型的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

舌下含服硝酸甘油是处理急性心绞痛的标准治疗方法。其药理机制是硝酸甘油经过代谢后产生1,2-二硝酸甘油，同时释放出有扩张血管活性的物质一氧化氮，一氧化氮通过增加细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）的含量而松弛血管平滑肌，缓解心肌缺血，降低心脏前后负荷，从而缓解心绞痛症状。

线粒体乙醛脱氢酶（ ALDH2）定位于12q24.2，全长43.4kb，含13个外显子，编码518个氨基酸。其主要功能是在肝脏内将乙醇代谢产物乙醛进一步脱氢成为乙酸，进入外周组织的三羧酸循环，分解产生CO2和水。近来研究发现，ALDH2在硝酸甘油的生物转化过程中起重要作用，是使硝酸甘油活化并释放一氧化氮的关键酶，具有酯酶活性，能特异性代谢硝酸甘油产生1,2-二硝酸甘油、亚硝酸盐和一氧化氮，实现血管扩张。研究显示硝酸甘油介导的血管扩张是cGMP依赖的，在体内外均能够被ALDH2抑制剂阻滞，而非cGMP依赖的血管扩张并不被影响；在受到硝酸甘油抑制的组织中，ALDH2的酶活性明显下降甚至完全失活，提示硝酸甘油耐受可能与线粒体乙醛脱氢酶功能缺失有关。

ALDH2第12外显子存在一个G/A单核苷酸多态，直接导致第504位谷氨酸被赖氨酸替代（Glu504Lys），突变的蛋白基本丧失了酶活性。这个单核苷酸多态在包括中国人群的亚洲人群中的等位基因频率最高，约30%，等位基因G的纯合子（标记为ADLH2*1 /ALDH2* 1）所编码的蛋白具有正常的酶活性，而杂合子（标记为ALDH2*1 /ALDH2*2）和等位基因A的纯合子（标记为ALDH2*2 /ALDH2*2）所编码的蛋白酶活性异常。在舌下含服硝酸甘油治疗心绞痛临床疗效与个体线粒体乙醛脱氢酶基因型的关联分析研究中发现80人中有59人对硝酸甘油有效（73.7%），其中等位基因G纯合子的个体有效率（47人中有40人，85.1%）要比至少携带一个等位基因A的个体有效率（33人中有19人，57.6%）高，比数比为4.21（99%可信区间，1.51~11.7）。结果显示舌下含服硝酸甘油治疗心绞痛与线粒体乙醛脱氢酶基因型显著相关（χ₂=7.59，p=0.006），经过性别、年龄和疾病严重程度等因素校正之后仍然显著相关。且在硝酸甘油药物代谢过程中杂合子和纯合子突变型ALDH2相较于野生型ALDH2而言，Km值升高，Vmax值显著降低，ALDH2 Glu504酶的催化效率比Lys504高出10倍，提示这个Lys504多态能够影响ALDH2的酶活性，降低硝酸甘油的生物转化能力。由此可见，线粒体乙醛脱氢酶Glu504Lys能够影响硝酸甘油生物活性的转化，通过对个体ALDH2基因Glu504Lys位点的基因型进行检测，可以用于评估硝酸甘油类药物对治疗个体心绞痛的有效性。

目前普遍应用的基因分型检测方法为Taqman探针法和DNA直接测序法。Taqman荧光探针两端分别标记报告基团和淬灭基团，探针在未与目标序列结合保持完整时，荧光报告基团和淬灭基团没有分离，荧光信号被淬灭基团吸收，不能受激发出荧光；PCR扩增时，完全互补配对后由Taq酶所具有的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光检测系统可以接到荧光信号，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如果探针与目标序列存在错配碱基，就会大大减少探针与目标序列结合的紧密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影响探针的荧光释放量，使带有不同碱基的DNA序列得以鉴定。这种方法步骤少，不易污染，便于对大样本进行分型；但对引物设计有一定的限制，对于SNP附近的序列有一定要求，受突变碱基位点与类型局限。DNA直接测序法能直接提供准确的碱基信息，被当成突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。

本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线（High resolution melting，HRM）分析技术。其原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，饱和性荧光染料高浓度占据双链DNA所有碱基对，当双链DNA局部解链时，荧光染料释放，荧光强度的降低精准可靠地反映出DNA分子的解链情况。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。

发明内容