[发明专利]稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9SNP及制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及稻瘟病技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9SNP及制备与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌（Magnapothe oryzae）引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。此外，由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植后的3～5年时间里逐渐丧失（殷得所等，2011），因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者具备丰富的经验及敏锐的观察力，而且鉴定结果也极易受到环境及人为因素的影响，从而导致降低了目标抗性基因的选育效率。随着分子标记技术的产生及发展，其便捷、直接、不受环境影响等优点使其应用价值及前景越来越受到关注。为了能更好地开展稻瘟病抗性育种工作，研究者们对水稻稻瘟病抗性分子机理进行了大量的研究，并开发得到了一批与主效抗性基因紧密连锁的DNA分子标记（Hittalmani et al.,2000；Jena and Mackill,2008），DNA分子标记在抗性基因的定位以及基于分子标记辅助选择（MAS）技术的抗性育种工作中起着越来越重要的作用。然而与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中需对亲本的多态性进行检测；此外，在减数分裂过程中，该类型的分子标记仍然存在着因染色体发生交换而失去了与目的基因紧密连锁关系的可能性，这使得在目的基因鉴定过程中会出现错选或漏选的情况（Hayashi et al.,2006；Ingvardsen et al.,2008）。同时，越来越多的研究表明，同一个抗性位点存在着多个抗谱不同的功能性等位基因，它们在序列上高度相似（Zhou et al.,2006;Ashikawa et al.,2008;Yuan et al.,2011;Zhai et al.,2011;Hua et al.,2012），因此，在基因聚合工作中，与目的基因紧密连锁的分子标记很难对功能性等位基因进行准确的鉴定与筛选。然而，基于基因内部序列所开发的基因特异性分子标记可以使上述问题得到有效的解决，从而提高抗性基因的利用效率，加快稻瘟病抗性育种的步伐。

到目前为止，至少有9个稻瘟病抗性基因（Pi2、Piz、Piz-t、Pi40、Pigm、Pi9、Pi26、Pi50、Pi2-2）已经被定位在水稻第6染色体短臂端的Pi2/Pi9基因簇内（Jiang et al.2012），其中Pi9、Pi2以及Piz-t已经被成功克隆（Qu et al.2006,Zhou et al.2006）。研究结果表明，Pi2和Piz-t在氨基酸水平上只存在着8个氨基酸残基的差异，二者与Pi9相比，氨基酸序列一致性分别都高达96%（Qu et al.,2006;Zhou et al.,2006）。抗性基因Pi9来源于野生稻，能抵抗来自13个国家和地区的43个稻瘟病生理小种的侵染（Liu et al.2002），国际水稻所用超过100个来自菲律宾的稻瘟病生理小种对携带有抗性基因Pi9的水稻品种75-1-127进行接种鉴定，并没有发现亲和菌株（Qu et al.,2006）。在国内，张国民等（2010）分析了24个单基因系对黑龙江优势菌群的抗性表现，其中携带有Pi9的单基因系对所有优势菌株和强致病力小种抗谱达100%。抗性基因Pi9所表现出的稻瘟病广谱抗性使其在稻瘟病抗性育种工作中具有极大的应用价值。为了加快抗性基因Pi9在抗性育种中的应用步伐，研究者已经开发出一些与Pi9连锁的基于PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术的分子标记（倪大虎等，2005；Tacconi et al.,2010；殷得所等，2011）用于分子标记辅助选择（MAS）育种工作。然而，这些标记位于抗性基因Pi9的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离，因此，在减数分裂过程中存在着与目标基因发生交换的风险，在抗性育种工作中容易发生错选或漏选的情况。为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi9应用到水稻抗性育种工作中，有必要在抗性基因Pi9的基因内部开发出Pi9特异的分子标记，这种基因特异性分子标记对目标基因筛选的准确率理论值达100%。

发明内容