[发明专利]一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织和细胞工程领域，具体地说，涉及一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法。

背景技术

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Müll.Arg.，以下简称橡胶树）是重要的热带经济作物，所产的天然橡胶是一种不可替代的工业原料和国防战略物资。随着国民经济的发展，我国已成为世界上最大的天然橡胶消费国，年需求量达380万吨以上，而我国目前年产量不超过80万吨，自给率仅20%左右，远未达到国际安全警戒线，如不尽快采取切实有效的措施提高天然橡胶的产量，将直接威胁到国家的经济发展和国防安全。由于受气候和地理条件的局限，在我国适合橡胶树栽培的面积十分有限，无法靠扩大栽培面积来增产，只能通过改良现有品种，提高其单位面积产量来达到增产目的。现阶段我国的橡胶产业主要还是通过传统的有性杂交方式来改良品种，并以种子实生苗作为砧木，以具有优良特征的多龄树芽条作为接穗，采用芽接方式进行种植。然而有性杂交仅能转移部分核基因组，对于控制许多重要农艺性状的胞质基因组的转移无能为力，使得可利用的基因资源十分有限。此外，作为砧木来源的橡胶树种子产量低、不耐储藏且良莠不齐，使得优质砧木的筛选和利用受到很大限制。而通过建立高效的橡胶树原生质体植株再生体系，在此基础上开展橡胶树体细胞杂交育种可克服上述问题。体细胞杂交不仅可以转移核质基因组，还可以转移胞质基因组，并在一定程度上克服远缘杂交的不亲和性，而且经原生质体融合获得的体细胞杂种往往具有一定的杂种优势，其抗逆性和花粉育性介于双亲之间甚至是高于亲本，配合使用常规育种技术，有望选育出优良材料，在橡胶树接穗和砧木的改良上均具有一定的潜力。

建立高效的原生质体植株再生体系是进行体细胞杂交育种的前提和基础。国外学者于上世纪八十年代率先开展橡胶树原生质体的分离和培养研究，然而由于橡胶树原生质体的再生相当困难，而且不同品种对相同培养条件的反应存在很大差异，致使很多学者在这一研究领域上均未能成功。直至2000年Sushamakumari等首次报道了橡胶树品种PRII105的原生质体培养成功获得完整的再生植株，然而此后一直未再有其它品种的成功报道。究其原因，可能是该培养体系不太适用于橡胶树其它品种，尤其是国内橡胶树品种的原生质体再生培养，而且该培养体系存在以下不足：（1）原生质体培养采用的KPR培养基（Abdullah等，1986）成分复杂，含有多种稀有昂贵的维生素，实验成本高且配制程序繁杂；（2）采用禾本科黑麦草悬浮细胞作为看护细胞，不易获得，而且经看护培养后的橡胶树原生质体分裂形成细胞克隆的频率较低。鉴于橡胶树原生质体培养再生植株存在的上述技术瓶颈，目前我国在这一领域尚未有任何相关的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单易行且普遍适用于国内橡胶树品种原生质体培养植株再生的方法。

为了实现本发明的目的，本发明一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法，包括胚性细胞悬浮系的建立、原生质体的分离和纯化、原生质体的看护培养、原生质体再生细胞克隆的继代增殖、体细胞胚的诱导及植株再生。具体步骤如下：

（1）胚性细胞悬浮系的建立：挑取2～4g常规方法诱导的橡胶树未成熟花药或内珠被胚性愈伤组织，转入含20～40ml液体培养基的100ml三角瓶中，置于100rpm摇床上，28±1℃、黑暗条件下进行悬浮培养，每周继代一次，持续继代60～90天得到稳定均质的胚性悬浮细胞系。

所述的液体培养基的组成为：改良的MS基本培养基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、0.1～0.4g·L^-1天冬酰胺、0.2～0.6g·L^-1酸性水解酪蛋白、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖；液体培养基的pH5.8，高温高压灭菌。

MS培养基的改良成分为：MgSO₄·7H₂O500mg·Ｌ^-1、KH₂PO₄400mg·L^-1、CaCl₂250mg·L^-1、MnSO₄·H₂O35mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O0.2mg·L^-1。