[发明专利]定量检测microRNA的PCR分析方法

说明书

技术领域

本发明属于检测分析领域，尤其涉及一种基于碱基堆积杂交原理的定量检测microRNA的PCR分析方法。

背景技术

MicroRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约18～25个核苷酸。成熟的microRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻止靶mRNA的翻译。microRNAs参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。microRNAs的异常表达通常与癌症的发生发展及对治疗药物的临床响应有密切联系，已成为一类理想的肿瘤标记物。所以定量分析microRNAs对了解microRNAs在癌症发生中的生物功能，癌症的早期诊断、疗效监测和预后判断具有十分重要的意义。与传统的核酸检测相比，microRNAs其独特的特点，如序列短，家族序列同源性高，低丰度表达，增加了其检测的难度。目前检测microRNAs的方法主要有Northern印迹分析，微阵列芯片，聚合酶链式反应（PCR），原位杂交技术等。从microRNAs的发现到现在microRNAs的分析研究中，Northern印迹技术一直被应用于microRNAs的鉴定和新microRNAs的发现。虽然Northern印迹是当前microRNA分析的标准方法，但其缺点是操作繁琐耗时长，灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。微阵列芯片技术虽然可实现高通量，多组分同时检测，但是其制作和检测费用高；芯片上可利用的样品体积很小，导致灵敏度不高；此外，microRNAs序列短，序列相似性高，不能同时优化所有待测的microRNAs杂交环境，所以选择性不高。反转录PCR（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）是高灵敏度定量检测microRNAs的主要方法。由于microRNAs序列较短，难以设计扩增引物，因此针对短序列microRNAs分析需要改进传统RT-PCR方法。近年来发展了多种基于RT-PCR信号放大的microRNAs检测新方法，有如引物延伸RT-PCR，茎环引物RT-PCR和microRNAs加尾RT-PCR等。虽然基于RT-PCR反应的microRNAs检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等特点，但是需要逆转录操作，这无疑增加了实验的成本和设计的复杂性。因此，开发简单直接，灵敏度高，特异性强，适用范围广，检测成本低，结果准确可靠的microRNAs分析技术仍然是一个挑战。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于碱基堆积杂交原理的定量检测microRNA的PCR分析方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种定量检测microRNA的PCR分析方法，包括以下步骤：

利用靶标microRNA与DNA扩增模板结合后，通过碱基堆积杂交作用稳定了正向引物与DNA扩增模板的结合，在DNA聚合酶作用下延伸正向引物，在与反向引物共同作用下，引发PCR反应，得到双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标microRNA的浓度。

所述靶标microRNA为let-7a、miR-141、miR-21、miR-200b。

所述let-7a为5′-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3′；DNA扩增模板序列为5′-GGCTAAGACAGATGCTCTTTGCCAACAGGCCACAGAATTCCTACACTCAAAGTCGTACTGAACTATACAACCTACTACCTCATCGCACT-3′。

所述miR-141为5′-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3′；DNA扩增模板序列为5′-GGCTAAGACAGATGCTCTTTGCCAACAGGCCACAGAATTCCTACACTCAAAGTCGTACTGCCATCTTTACCAGACAGTGTTATCGCACT-3′。