[发明专利]一种定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，尤其是涉及一种定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的试剂盒。

背景技术

结核病(tuberculosis)俗称痨病，是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis)引起的传染性疾病，是全世界由单一致病菌引致死亡最多的疾病。随着二十世纪医药进步和卫生条件的改善，这种曾经蔓延全球，造成数亿人死亡的白色瘟疫已经得到了有力的控制。但是近年来，由于流动人口的增加、艾滋病的流行以及耐药性菌株的产生，使结核病再度成为一种人类感染发病和死亡最多的传染病之一。据世界卫生组织（WHO）报道，2005年全球已有近1/3约20亿人口感染了结核分枝杆菌，现有结核病患者2000万人，每年约有200万人死于该病，2004年新增结核病例约为900万人。我国是结核病高发国家之一，结核病患者人数居全球第二位，仅次于印度。

 我国结核病现状呈现“六多”的特点：一、感染人数多，目前全国约有5.5亿人感染过结核分枝杆菌，感染率达44.5%，高于全球1/3的感染率水平。二、患病人数多，全国结核病患者约为500万人，患病人数居世界第二位。三、新发患者多，全国每年新发生肺结核患者约145万人。四、死亡人数多，全国每年约有13万人死于结核病。五、农村患者多，全国约有80%的结核病患者集中在农村。六、耐药患者多，全国菌阳肺结核病人中耐药病人约占1/4。因此，要控制结核病的发生与流行就必须加强对结核病的诊断学研究，研究快速、准确、敏感、特异以及简便的诊断方法是有效地控制结核病蔓延的关键。

近年来，有一类用于诊断结核分枝杆菌感染的新方法进入了人们的视线 ,即γ-干扰素释放试验 ( interfer on gamma release assay, IGRA) ,这类试验采用ELISA (酶联免疫吸附)方法定量检测全血在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下释放γ-干扰素的水平,用于诊断结核分枝杆菌感染以及结核病。

   人体对于结核分枝杆菌感染的免疫反应主要是细胞免疫。T淋巴细胞和巨噬细胞的作用关系到感染的进程和演变。巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后,就会把它们消化成大小不一的片断。特异片断 (抗原肽)与巨噬细胞和其他抗原递呈细胞的主要组织相容性复合体 (人白细胞抗原)相结合,表达于巨噬细胞表面,并递呈给T细胞。特异性 CD4+ T细胞能产生特征性淋巴因子,包括一种能够刺激T细胞增殖的生长因子白介素-2和一种巨噬细胞反应中介物γ-干扰素,γ-干扰素为巨噬细胞杀菌机制所必需。IGRA将结核分枝杆菌特异性抗原加入受试者的血液标本的培养基中进行孵化 ,如果受试者受到过结核分枝杆菌感染 ,那么被结核分枝杆菌激活的记忆T细胞就会对这些特异性抗原产生反应 ,发生增殖分化并释放出γ-干扰素以及其他一些细胞因子,我们可以通过相关免疫学实验方法定量检测γ-干扰素的释放水平。通过这样的试验，我们可以诊断是否存在结核分枝杆菌感染。该试验的灵敏度和特异性均远远高于结核分枝杆菌素皮肤试验，因此在诊断结核分枝杆菌感染方面更有价值。

目前用于检测γ-干扰素的方法主要有酶联免疫斑点技术（ELISPOT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和磁微粒化学发光法（CMIA）。ELISPOT有较高的检测灵敏度，但由于该方法需要在抽取病人全血后，分离出其中的淋巴细胞进行过夜培养，再进行检测，操作步骤比较繁琐，造成操作人员的工作量比较大；且该产品属国外进口产品，价格昂贵，另外还需要配套使用但试剂盒并不提供的一些试剂，如淋巴细胞分离液、淋巴细胞分离过程中用到的进口无血清细胞培养基、无菌15ml离心管、水平转子离心机、超净工作台、无菌吸管或移液器、细胞计数仪等等设备，增加了实验结果出错的几率，中间每一个步骤都能关系到最终结果的准确性。ELISA 法采用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，缩略词为HRP)或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但ELISA 法的检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目，并且反应时间比较长，检测步骤包括：加样、孵育、洗板、加底物显色、终止、检测等程序，检测时间超过90min。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高、特异性好，且检测过程简单、不需要复杂仪器的定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：