[发明专利]绵羊ISG15重组蛋白及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及绵羊ISG15重组蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

ISG15是干扰素刺激基因15 (interferon-stimulated gene 15，isg15)，其编码蛋白为ISG15蛋白。ISG15蛋白是在病原微生物或I型干扰素的刺激下高效表达的一种蛋白质，后续的研究证实ISG15所编码的氨基酸序列实际包含165个氨基酸残基，分子质量为17.89 ku。ISG15具有细胞因子活性、调节干扰素信号通路、抗病毒及抗细菌感染等功能，在先天性免疫中发挥着重要作用。ISG15蛋白在各种生物体中存在一定差异，目前并没有关于巴什拜羊中该蛋白的作用的报道，且目前关于ISG15的报道主要集中在人和鼠上，均是在抗病毒等方面的研究，并没有ISG15蛋白在抗支原体肺炎方面的研究报道。

盘羊是国家二级野生保护动物，主要特征是体型大、脂肪少和抗病力强；巴什拜羊是以生产肉、脂为主的地方良种，生长发育快，耐寒冷，抗病力强。马长宾等将新疆野生盘羊与巴什拜母羊成功杂交（简称盘羊杂交羊，盘羊、巴什拜羊均为绵羊品种），并报道了其杂交一代羊继承了盘羊体形大,巴什拜羊生长发育快的生产性能。进一步研究发现，盘羊与巴什拜羊杂交的后代在生长发育早期大量死亡，调查死亡原因发现，盘羊的杂交后代非常易感绵羊支原体肺炎，而同一饲养条件下的巴什拜羔羊则未发该病，本申请人在对巴什拜羊长期的跟踪调查过程中发现，该羊对绵羊肺炎支原体的感染具有较强的抗性，即使被感染也不表现出明显的临床症状。ISG15基因为羊的疾病抗性相关基因，因此，本申请人认为，当地巴什拜羊所表现的较强的抗病能力可能与ISG15基因有关。我们推测盘羊的杂交后代可能存在先天性免疫缺陷有关，而先天性免疫降低则与羊的疾病抗性基因变异有关。

发明内容

本发明提供了绵羊ISG15的重组蛋白，应用该重组蛋白能在一定程度上治疗绵羊支原体肺炎，本发明还提供编码该重组蛋白的基因及其在治疗绵羊支原体肺炎中的应用。

    本发明的第一个目的是提供用于治疗绵羊支原体肺炎的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：

1）、SEQ ID No.1中所示核苷酸序列；或

SEQ ID No.3中所示核苷酸序列；

2）、与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

3）、对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

    盘羊杂交羊与巴什拜羊有三处核苷酸差异，导致盘羊杂交羊的一个氨基酸改变。但是一个氨基酸的改变并未导致功能（治疗绵羊支原体肺炎）的改变，因此，申请人有理由相信，对序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，形成的新的核苷酸序列，有极大可能同样能够治疗绵羊支原体肺炎，这些均是在本发明的核苷酸序列的基础上推断出来的，因此，均在本发明的保护范围之内。

    本发明的第二个目的是提供一种重组质粒，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上所接受的载体，例如所述载体为pPIC9K。

    本发明的第三个目的是提供一种重组蛋白，其氨基酸序列为权利要求2所述的重组质粒编码。

    本发明的第四个目的是提供一种重组菌株，其包括权利要求2所述的重组质粒。

    进一步地，所述重组菌株是将权利要求2中所述的重组质粒转化至巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中。

     本发明的第五个目的是提供权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的重组质粒、权利要求3所述的重组蛋白、权利要求4或5所述的重组菌株在治疗绵羊支原体肺炎中的应用。

本发明利用RACE技术对新疆巴什拜羊ISG15基因的全长cDNA序列进行扩增，并且成功获得了该基因的cDNA全长序列。其次，本发明成功构建了重组真核表达载体pPIC9K-ISG15，并且成功实现了巴什拜羊ISG15在毕赤酵母中的分泌表达，但分泌表达量不高，诱导表达条件有待进一步优化。由于目的蛋白带有his标签能够与Ni²⁺-NTA 树脂特异性结合，分离的目的蛋白纯度较高，而且Ni²⁺-NTA 树脂可再生反复利用。因此，本发明采用Ni²⁺螯合亲和层析法对目的蛋白进行分离纯化。纯化产物经SDS-PAGE分析条带较为单一，表明成功获得了33kDa大小的目的蛋白。最后用淋巴细胞转化试验来检测纯化产物的活性，纯化产物能够刺激淋巴细胞增殖，表明表达产物具有活性。