[发明专利]一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码D-氨基酸氧化酶的基因daoE及其应用。 

背景技术

D-氨基酸氧化酶催化D-氨基酸脱氨基生成相应的α-酮酸，从结构较为简单原核生物的到结构相对复杂真核生物，再到功能进化高级的如哺乳动物的人类，都存在各种各样的D-氨基酸氧化酶，并在其中发挥着巨大的作用。D-氨基酸氧化酶一般为单一肽链蛋白质，较多为400个氨基酸左右。D-氨基酸氧化酶的一级序列包含保守的I-V保守区域，I区是极其保守GXGXXG序列，存在于DNA序列5’端起始位置，是结合上黄素腺嘌呤二核苷酸的保守位点，是一个包含α/β组合的Rossman结构。D-氨基酸氧化酶具有广泛的底物特异性，II-V保守区域执行对这些不同氨基酸的结合和催化功能通常包含2个Tyr和1个Arg氨基酸残基中的一个。D-氨基酸氧化酶具有典型的立体异构催化模式，即只会作用于D型氨基酸，它广泛底物特异性主要表现在能够催化除了酸性氨基酸D-谷氨酸和D-天门冬氨酸外的所有D-氨基酸。D-氨基酸氧化酶的活性中心主要由两部分组成，第一部分包含两条β-链弯曲围绕黄素腺嘌呤二核苷酸的异咯嗪环的主要活性中心位置，第二部分是由两条短的β-链组成的底物结合区域。 

D-氨基酸氧化酶在人体疾病中的治疗靶点，这些疾病的机制都是D-氨基酸氧化酶的生成量过高。神经源性疼痛是由中枢或外周神经系统损伤、疾病引起 的疼痛综合征，发生机制与多种机制有关，尚未明确。D-氨基酸氧化酶的抑制剂苯甲酸钠可以对慢性神经源性疼痛起到强效镇痛作用，慢性疼痛主要是由脊髓自由基过氧化氢介导，机制在于抑制脊髓过氧化氢的生成。在精神分裂症患者体内中D-氨基酸氧化酶与D-丝氨酸代谢模型：pLG蛋白表达量下降，而人的D-氨基酸氧化酶活性水平反常的升高，诱导体内D-丝氨酸浓度的减少，导致人精神分裂症的产生。所以，D-氨基酸氧化酶作为其中重要的识别位点发现精神分裂症和慢性神经源性疼痛的易感基因对于认识两种疾病的症代谢过程、识别潜在药物靶点和指导用药等方面具有指导意义。 

D-氨基酸氧化酶的农业应用主要在于提高经济作物的生长能力。具有取代抗生素基因和除草剂基因的前景。植物容易从环境中吸收D-氨基酸，植物细胞不具有内源性D-氨基酸氧化酶的能力，它们具有D-氨基酸的代谢能力有限，D-氨基酸在植物细胞中的积累将会抑制其生长。2009年，Lin等证实三角酵母D-氨基酸氧化酶在水稻中的成功表达，植物异源的D-氨基酸氧化酶不引起植物生长的总异常，此功能已被利用作为开发一种有效的生物技术工具，将感兴趣的基因一起集成到D-氨基酸氧化酶标记中，通过生长植物的介质上包含D-丙氨酸的培养基中逆向性选择植物。目前，在拟南芥、苹果和水稻等作物中已经成功表达了D-氨基酸氧化酶，研究表明这些转基因植物有效地转换成D-氨基酸，生成对其无害的α-酮羧酸类产物。 

D-氨基酸氧化酶的工业生产应用广泛。从猪肾中提取的D-氨基酸氧化酶可以直接于D型氨基酸将其脱氨基生产α-酮酸。利用D-氨基酸氧化酶的立体异构专一性，将D-氨基酸氧化酶作用于DL-丙氨酸，D-氨基酸氧化酶可以催化其中的D-氨基酸生成酮酸，其中的L-氨基酸不能被催化，从而达到分离DL-氨基酸 来获得L-氨基酸的目的。D-氨基酸是构成细胞壁肽聚糖和胞壁酸的成分，微生物含有的D-氨基酸氧化酶，它们能够利用D-氨基酸进行生长，对食品D-氨基酸的检测是判断食品细菌污染的指标之一。Wcislo等在2007年报道了将D-氨基酸氧化酶固定在普鲁士蓝修饰的碳纳米管的安培生物传感器，利用普鲁士蓝修饰的碳纳米管作为载体工具，D-氨基酸氧化酶被固定在表面后用来检测食品D-氨基酸含量，这种检测方法的灵敏度可以达到5-200nmol/L。