[发明专利]一种大菱鲆自然杀伤细胞增强因子表达载体的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种大菱鲆自然杀伤细胞增强因子表达载体的应用。

背景技术

自然杀伤细胞增强因子(Natural killer enhancing factor,NKEF)是抗氧化剂家族(Peroxiredoxin)的重要成员，分子量约22kD。它最早是从人的红细胞中分离纯化，能够增强自然杀伤细胞的细胞毒活性。目前已知自然杀伤细胞增强因子参与多种生物功能，包括细胞的增殖、分化、凋亡以及抗感染免疫。自然杀伤细胞增强因子基因在各种组织中均有不同程度的表达，当机体受到病原感染时，活化后的CD8+细胞能分泌大量的自然杀伤细胞增强因子，从而增强NK细胞的细胞毒性，并促使其分泌大量炎性细胞因子，包括γ-干扰素和多种细胞因子，一方面使病原的增殖受到抑制，另一方面加快病原的清除。因此，自然杀伤细胞增强因子在机体抵抗病原微生物感染过程中起着重要作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种大菱鲆自然杀伤细胞增强因子的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种大菱鲆自然杀伤细胞增强因子表达载体的应用，所述自然杀伤细胞增强因子在制备鱼类抗细胞肿大病毒感染的应用。

所述自然杀伤细胞增强因子在制备抗虹彩病毒感染的应用。

将所述自然杀伤细胞增强因子表达的质粒pSmNKEF在PBS中稀释至200ug/ml，待用。

所述质粒pSmNKEF，以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物与载体pEASY-E2连接，获得质粒pEASY-NKEF；用限制性内切酶EcoRV酶切pEASY-NKEF后回收0.6kb片段，与质粒pCN3连接，得质粒pSmNKEF。

本发明具有如下优点：本发明的自然杀伤细胞增强因子表达质粒注射鱼类后能够显著提高鱼类抗病毒感染能力。

附图说明

图1为本发明的自然杀伤细胞增强因子表达质粒pSmNKEF在抗病毒侵染中的应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001）。

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

自然杀伤细胞增强因子表达质粒pSmNKEF的构建：

大菱鲆自然杀伤细胞增强因子的序列已公开（GenBank accession No.ACE80210.1）。以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94°C60s预变性模板DNA,然后94°C40s,55°C60s,72°C60s,5个循环后改为94°C40s,65°C60s,72°C60s,30个循环后再在72°C延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。PCR产物用T4DNA连接酶与载体pEASY-E2(购于TransGen Biotech,北京)在室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素（100ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为质粒pEASY-NKEF。用限制性内切酶EcoRV酶切pEASY-NKEF后回收0.6kb片段；将质粒pCN3（构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine2009;27:5195–202.）用EcoRV酶切,回收5.4kb片段。将上述两片段用T4DNA在室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（50ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pSmNKEF。通过DNA测序分析证明了pSmNKEF为含有自然杀伤细胞增强因子序列的表达质粒。