[发明专利]一种膜分离制备依诺肝素钠工艺

说明书

技术领域

本发明涉及利用膜分离技术制备依诺肝素钠的方法，属于生物工程技术领域。

技术背景

肝素(heparin)是由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸组成的一类长链多糖，广泛存在于小肠粘膜、肺等动物器官和组织，目前主要从哺乳动物的肥大细胞中分离得到。肝素通过与其它不同蛋白结合，可发挥重要的生物活性，具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能,它可以激活抗凝血酶，加速抗凝血酶在凝血连锁中抑制丝氨酸蛋白酶的速率，从而作为一种抗凝血的药物被广泛应用。但长期使用会产生许多负面影响,如出血和诱导血小板减少、骨质疏松等副作用。这些缺点限制了肝素在临床上的应用。因此，人们研制出了新型抗凝血药物，低分子量肝素(LMWH)。这类药物具有链短、结合部位少，生物利用度高，且半衰期长等优点，因而具有很好的医疗前景。

依诺肝素钠是低分子肝素的一种，主要用于抗血栓、抗凝血、治疗急性心梗和不稳定性心绞痛等。其抗凝机理复杂，适应症比较广泛，对凝血的各个环节均有作用。包括抑制凝血酶原转变为凝血酶，抑制凝血酶活性，妨碍纤维蛋白原转变为纤维蛋白，防止血小板凝聚。依诺肝素钠可通过降低LDL和VLDL，升高HDL，来改变血液粘稠度，保护血管内皮细胞，预防血栓和动脉粥样硬化，改善冠状动脉循环等作用。依诺肝素钠具有临床适应症广，生物利用度高，体内半衰期长，副作用小等优点，其市场占有率达到肝素类药物的2/3以上。

依诺肝素钠生产目前主要采用的是β-消除降解法工艺，该工艺方法存在的一个普遍问题是得到的目标产物分子量大小不均匀，需要对不同分子量段进行分级，以达到药用要求，而广泛应用的传统乙醇分级沉淀工艺方法步骤较为繁琐，并且产生大量废乙醇需要回收处理。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明采取用不同孔径的膜对药液进行超滤处理，截取获得平均分子量及分子量分布范围符合要求的高活性依诺肝素钠产品。

为实现本发明目的，这种膜分离制备依诺肝素钠工艺包括以下步骤：

a. 季铵盐盐化

将肝素钠水溶液与苄索氯水溶液以 1/1.5～2.5的体积比混合后在45～50℃下进行反应，反应 2～4小时后将沉淀物洗涤、烘干得到肝素季铵盐，所述肝素钠和苄索氯铵质量浓度比为1/2.5～3；

b. 苄基酯化

将肝素季铵盐溶解到5～7质量倍的N,N-二甲基甲酰胺有机溶剂中后，加入肝素季铵盐1～4质量倍的氯化苄后在25～35℃下进行酯化反应；

c. 降解

上述酯化20～30小时后再将酯化反应产物加入氢氧化钠在40～60℃下进行反应，所述氢氧化钠用量为酯化反应产物重量的6～12%；

d. 氧化脱色

上述反应30～60min后，将降解产物加入1～1.5%v/v反应液体积的30%浓度的双氧水氧化脱色；

e. 过滤除杂

以40～80 g/L的用量向上述反应体系中加入活性炭后，在0.05～0.12MPa下过滤；

f. 分级超滤

将过滤除杂的滤液用MWCO8kDa孔径的滤膜在0.22～0.28MPa下超滤，以去除分子量高于8kDa的肝素钠降解产物，滤液再用MWCO2kDa孔径的滤膜在0.18～0.24MPa下超滤，以截留得到分子量低于2kDa的依诺肝素钠降解产物。

本发明的有益效果：此发明关键在于采用不同孔径的膜超滤技术来实现控制产物的分子量和分子量分布范围，制备出高纯度、高活性的依诺肝素钠产品。本发明生产工艺是在特定条件下利用β-消除法将普通大分子肝素钠降解为低分子量肝素钠。本发明采取了双氧水氧化脱色和活性炭过滤除杂的工艺，有效去除了反应体系中的杂质并且显著改善了产品的色度。

附图说明

图1 为本发明依诺肝素钠生产工艺流程图。

具体实施方式

实施例1：如图1所示，

a.亲水反应体系制备肝素-苄索氯铵盐

向30升30～40℃纯化水中加入3kg肝素钠（注射级去DS），搅拌使之完全溶解；向50升45～50℃纯化水中加入8kg苄索氯铵，搅拌使之完全溶解。然后将溶解的肝素钠溶液在搅拌下缓慢加入到溶解的苄索氯铵溶液中，加完后在45～50℃下持续搅拌30～60min后，将生成的沉淀物离心，弃去上清液，得到肝素盐化物。用100升纯化水洗涤肝素盐化物后，离心弃去上清液，洗涤离心重复操作3～4次后，开启热风循环烘箱，将离心后的肝素盐化物在烘箱中于50～60℃下干燥18～24小时，得到含水量低于10%的肝素盐化物；