[发明专利]同时检测双壳类水产品中AZA1、AZA2和AZA3的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定双壳类水产品中多种原多甲藻酸类贝类毒素的方法，特别涉及一种用液相色谱-串联质谱法同时测定双壳类水产品中三种主要原多甲藻酸类贝类毒素AZA1、AZA2和AZA3的方法。

背景技术

原多甲藻酸（Azaspiracids,AZAs）贝类毒素是一类脂溶性聚醚生物毒素，由原多甲藻(Properidininm crassipes)产生，碳骨架由40个碳原子组成，分子中有20个立体异构中心和9个环，具有独特的6,5,6-三螺环和环胺结构(见结构式1)，属氨代螺旋酸类贝类毒素。AZA1在AZAs贝类毒素中最为常见，且所占比例最高，AZA2和AZA3则分别是AZA1的8-甲基和22-脱甲基衍生物，这3种贝类毒素构成了原多甲藻酸类贝类毒素的主要成分。AZAs贝类毒素毒性强且比较稳定，AZAl、AZA2和AZA3对小鼠腹腔注射致死剂量分别为200μg/kg、110μg/kg和140μg/kg，人食用含有AZAs贝类后会出现恶心、呕吐、腹泻、胃痉挛等症状。2002年3月，欧洲委员会规定双壳类水产品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允许浓度为160μg/kg(以贝肉计)。

小鼠生物检测法(MBA)是以往检测贝类毒素的常用方法，但因其存在不能判定多种毒素的具体组分，专一性、灵敏度和准确性均欠佳，重现性差等缺点，已被欧盟于2011年采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法取代。目前，对AZAs贝类毒素的检测多限于AZA1，而单一的AZA1测定结果不能作为双壳类水产品中AZAs是否超标的判断依据，且所建检测方法还存在着样品处理操作繁琐，耗时长等问题。

结构式1.原多甲藻酸类贝类毒素化学结构式

其中，AZA1:R₁=H,R₂=CH₃;AZA2:R₁=CH₃,R₂=CH₃;AZA3:R₁=H,R₂=H

发明内容

本发明针对上述技术问题，通过完善目标分析物种类，改进样品的处理方法，提供了一种同时检测双壳类水产品中多种原多甲藻酸类贝类毒素的方法，该方法可同时检测原多甲藻酸类贝类毒素中的AZA1，AZA2和AZA3三种主要成分，在提高了检测分析效率的同时，为双壳类水产品中AZAs贝类毒素残留的监控及检测提供了技术支持，也为贝类产品的品质控制和质量提高提供了可靠保证。

本发明的目的在于提供一种测定双壳类水产品中多种原多甲藻酸类贝类毒素的方法，所述方法包括如下步骤：

提取：a向待测样品中加入体积浓度为75～85%的甲醇水溶液，涡旋提取后，离心取上清液；b向上清液中加入正己烷，涡旋提取后，静置分层去除正己烷层，得到提取液Ⅰ；c向提取液Ⅰ中加入氯仿，涡旋提取后，离心取下层液；d将下层液旋转蒸发至近干后，加入甲醇和水溶解混合均匀，得提取液Ⅱ；

净化：将提取液Ⅱ过MAX混合型阴离子交换反相吸附固相萃取小柱（MAX固相萃取小柱），以乙酸钠水溶液-甲醇的混合液为淋洗液进行洗涤后，以体积比为98:2的甲醇:甲酸混合液为洗脱液进行洗脱，收集洗脱后的溶液，加甲醇定容，混合均匀后，过滤膜，待检测；

检测：采用液相色谱-串联质谱仪进行检测。

本发明的技术方案中，将双壳类水产品中的壳内可食部分组织取出，清洗后，在9500r/min下均质5min，得到待测样品。

本发明的技术方案中，步骤a中，甲醇水溶液与待测样品的体积-质量比为4mL:1g，涡旋提取2min，重复提取2次后，在4℃以下离心5min。

本发明的技术方案中，步骤b中，按正己烷与甲醇水溶液的体积比为2-3:8加入正己烷后，在1500r/min的条件下涡旋提取1min。

本发明的技术方案中，步骤c中，按氯仿与甲醇水溶液的体积比为7-8:8加入氯仿后，在1500r/min涡旋提取2min，4℃下以8000r/min离心2min。

本发明的技术方案中，MAX固相萃取小柱使用前，依次用等体积的甲醇和水进行预洗。

本发明的技术方案中，所述淋洗液中，乙酸钠水溶液：甲醇按体积比为95:5混合，其中，乙酸钠水溶液的浓度为50mmol/L。

本发明的技术方案中，所述液相色谱-串联质谱仪的检测条件为：