[发明专利]一种烟草青枯病分子检测引物、检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治领域，具体涉及一种烟草青枯病病菌分子检测引物、检测方法及应用。

背景技术

烟草青枯病的病原为茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)，杆状，无荚膜，革兰氏染色阴性。这种病原菌寄主范围超过200个种，包括了许多重要的经济作物，如番茄、马铃薯、烟草。因此，快速的早期诊断对于控制青枯病的发生蔓延以及重大损失的发生具有重要意义。

随着基因组测序技术的发展和生物信息学数据的积累，多个Ralstoniasolanacearum菌株的基因组学列已经被公布，其中GMI1000菌株的测序结果公布最早，且注释信息最详细，已经成为其他菌株基因组研究的参考。在Ralstoniasolanacearum基因组编码的众多蛋白中，flic基因编码鞭毛亚基蛋白(1)，N-端和C-非常保守，但是中间区域变异明显，可以被用来作为不同菌种和不同菌株鉴定的依据。正因如此，flic基因常被作为高特异性、高灵敏性PCR检测的目标基因（2）。

环介导的扩增首先由Notomi报道，这是一种极具前景的新方法，可以广泛应用于病原微生物的快速检测。这种方法需要一组引物，这组引物共6条，经过特殊设计，可是识别6个不同模板并能在Bst聚合酶大亚基作用下完成链取代式的DNA合成，原理核心 LAMP 的原理核心是针对靶基因 6 个区域设计的 6条特殊引物和具有链置换活性的Bst（Bacillus stearothermophilus）DNA 聚合酶。在Bst DNA 聚合酶最适温度 60~65℃恒温条件下，利用可以产生环状结构的引物和Bst DNA 聚合酶链置换合成的活性，在靶序列两端引物结合处循环不断地产生环状单链结构，使得引物在等温条件下引发新链合成，从而使靶基因高效扩增。反应产物既可以通过传统的琼脂糖凝胶电泳检测，也可以直接加入SYBR green染色剂，通过颜色变化肉眼识别。

目前烟草青枯病病原菌的检测主要用的PCR检测法，对专业仪器依赖重，并且检测时间较长的确定，而本发明利用环式等温扩增原理，为烟草青枯病病原菌的检测设计了一套分子检测引物，利用这套引物，通过环式等温扩增反应，可以快速准确的完成烟草青枯菌的检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有技术中烟草青枯病病原菌的检测主要用的PCR检测法，对专业仪器依赖重，并且检测时间较长，本发明提供一种基于环式等温扩增原理的烟草青枯病分子检测引物、检测方法及应用，利用环式等温扩增原理，为烟草青枯病病原菌的检测设计了一套分子检测引物，利用这套引物，通过环式等温扩增反应，可以快速准确地完成烟草青枯菌的检测。

本发明采用的技术方案：

本发明烟草青枯病病原菌分子检测引物， 由上下游内引物、上下游外引物

和环引物组成，所述分子检测引物的DNA序列为：

上游外引物（F3）：5’-AGCCGGAACAAGTATTCATC-3’

下游外引物（B3）：5’-TGGCGTTCTGAATACCTTG-3’

上游内引物（FIP）：

5’-ACTGCGATTGCGACAGGGCCTCAGCCTCAATACCAAC-3’

下游内引物（BIP）：

5’-GCTCTGCAAAAGTCGCTGCGTAGGCCGCAGAATCATC-3’

环引物F（Loop F）：5’-CGTTTGCAGGGACGAGAT-3’

环引物B（Loop B）：5’-CGGTCTGCGTGTGAACAG-3’ 。

本发明烟草青枯病病原菌分子的检测方法， 包括以下步骤：以提取的疑似感

病烟草总DNA为模板，利用上述的分子检测引物进行环式等温扩增，反应结束后，根据反应产物的颜色判定结果，反应产物为绿色的，即为烟草青枯病病原菌检出。

更进一步，烟草青枯病病原菌分子的检测方法，在25ul体系中，上游内引物