[发明专利]一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种百合花药离体培养的方法，具体涉及一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法。

背景介绍

黄精灵百合是百合种类中花朵较为鲜艳、美丽的一大类，其花朵能够散发出强烈的香味，尤其受到人们的追捧，目前在我国南方一些地区被人们广泛种植栽培，视为观赏类百合不可多得的品系。目前百合的繁殖方式主要通过扦插繁殖、分球繁殖以及组织培养方式繁殖，随着我国社会与经济的发展与进步，人们对身边的花卉越来越重视，百合的种植面积和数量迅速增加，但通过扦插繁殖和分球繁殖方式繁殖的百合一般容易受病毒等侵扰，致使其品质逐渐下降，往往一些优良性状得不到很好的传代而丢失，有报道称通过分球繁殖的百合其病毒病发病率可达到40%-50%。

现在随着植物组织培养技术的发展，通过组织培养获得脱毒百合的技术不断完善，越来越受到人们的广泛应用，例如申请号为201210050972.2的中国专利公开的“东方百合种球脱毒方法”，综合运营热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的脱毒方法，获得脱毒种球。又如申请号为201110071320.2的中国专利中公开的“细叶百合的组织培养方法”，采用细叶百合的鳞茎作为外植体，经过脱分化、再分化培育出脱毒百合。但是这些方法虽然能够得到脱毒百合，但得到的百合大多数为杂交，后代可能会出现性状分离。如何得到遗传物质为纯合的黄精灵百合呢？因此需要寻求一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述百合在培育过程中易受病虫害侵扰、以及后代遗传物质不纯正等问题，提供了一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：包括百合花苞的选择与剪取、花苞低温处理与低温处理、花药接种与花药诱导培养、胚状体芽根诱导培养、幼苗秋水仙素加倍处理以及幼苗驯化培养。

所述的高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，具体步骤如下：

a、百合花苞的选择、剪取与低温处理

选择生长状态较好且处于花粉发育单核期的黄精灵百合的花苞，将花苞剪下后放置在5℃冰箱中处理3天；

b、花苞消毒处理与低温处理

将低温处理后的花苞用无菌水冲洗3次，投入到0.1%升汞溶液中消毒10min，取出后在75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗干净；接着在无菌环境中切开花苞，剥取花药，得到的花药在75%酒精中浸泡30s，后在0.1%升汞溶液中处理7min，然后在5℃冰箱中处理3天；

c、花药接种与花药诱导培养

将低温处理后的花药接种在诱导愈伤组织形成的改良MS培养基中，每瓶培养基中加入花药10-15粒，置于人工气候培养箱中培养；所述培养条件为黑暗培养，温度为27℃，相对湿度为70%，接种4-5周后花药萌发形成黄白色、较小、生长缓慢的胚状体；

d、胚状体芽根诱导培养

胚状体形成后，将其分别转入MZ₁培养基中继续培养诱导其根、芽生长，先诱导胚状体芽分化生长，然后再诱导其根分化生长，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；先培养2-3周后，待胚状体嫩芽长出后，将胚状体转移到MZ₂培养基，其他培养条件不变；在MZ₂培养基培养2周左右，胚状体即长出新根；

e、幼苗秋水仙素加倍处理

将诱导培养长出新芽新根的胚状体从培养基中取出，置于添加有300mg/L-500mg/L秋水仙素的不含凝固剂琼脂的液体改良MS培养基中，放在温度为25℃的摇床中，40转/分钟振荡培养2天左右；加倍处理后，将胚状体取出后，用无菌水反复冲洗3次，洗去胚状体上沾有的秋水仙素，将胚状体接种到新的改良MS培养基中继续培养，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；

f、幼苗驯化培养

当幼苗株高长到5cm-8cm，具有5-6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理1-2周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态。