[发明专利]高灵敏度的三磷酸腺苷检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别是涉及一种高灵敏度的三磷酸腺苷检测方法。

背景技术

ATP（三磷酸腺苷）生物发光法是基于萤火虫发光原理，利用荧光素酶-荧光素体系，检测三磷酸腺苷(ATP)数量的一种快速有效的方法。ATP生物发光法的原理是虫荧光素酶(luciferase)在镁离子存在下，催化虫荧光素(luciferin)和ATP形成中间物后氧化成氧化型的荧光素，产生AMP（腺苷一磷酸），并将化学能转化成光能，释放出光子。

在一定的ATP浓度范围内，此反应所释放出的光强度与体系中存在的ATP数量成良好的线性关系。因为三磷酸腺苷(ATP)存在于所有的活体细胞中，并且各生长期的细菌都还含有较恒定的ATP 量，因此这可以作为一种活体细胞的指示剂，通过ATP生物发光法检测出ATP数量，并由此推算出体系中细菌的数量。与传统的平板培养法相比，这种方法能快速得到结果，并且操作者无需技术，方法简便易懂，更容易被普通人群接受，而平板培养法所需时间较长，通常需要培养24-48小时，才能得到最终结果，并且对操作者的技术要求较高，操作复杂。

随着研究深入，已有结果表明ATP生物发光法有着极高的灵敏度，可检测到10^-17molATP甚至更低，约相当于五个细菌的ATP量，大大满足了HACCP快速检测微生物的要求。近年来，此方法已被食品工业、医药行业以及卫生监督系统等领域采用，如通过ATP生物发光法对原料奶微生物与体细胞浓度进行检测，由此监测原料奶中微生物数量以及研究奶牛的健康状况对牛奶的影响。此外在食品的生产过程中，对设备卫生，环境卫生，个人卫生的管理，防止产品的二次污染。此外，这种方法还可用于肉及肉制品杂菌污染的测定、啤酒酵母的活性测定等。

ATP生物发光技术基于其快速，灵敏，简便的优点，将会成为一种快速简便检测微生物数量和检测食品生产环境洁净度的有效方法。

由于市场上常见的荧光素酶和荧光素都是通过基因工程技术发酵生产所得，所以即使经过严格的操作，标准的酶液中可能还会含有微量的ATP残留，因此造成检测酶液本身的发光强度较高，试剂本身背景值较高，不利于提高发光检测灵敏度。在这种情况下，多数试剂盒说明书要求在配置好检测酶液后，在室温下静置一段时间以消耗其中的ATP残留，但长时间在常温下放置，这势必会降低检测酶的活性，最终导致检测灵敏度降低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度的三磷酸腺苷检测方法，其利用纳米技术去除试剂本底残存的ATP（三磷酸腺苷），降低试剂本身的发光值，从而提高试剂的检测灵敏度。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种高灵敏度的三磷酸腺苷检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤一，制备氨基化磁性纳米粒子；

步骤二，制备固定化三磷酸腺苷检测酶系统；

步骤三，对配置好的三磷酸腺苷检测酶系统进行预处理，清除酶系统中残留的三磷酸腺苷；

步骤四，使用MPI-B化学发光检测仪进行三磷酸腺苷测定。

优选地，所述步骤一具体包括以下步骤：将10g 1,6-己烷二胺、5g 无水醋酸钠、4g FeCl₃·6H₂O 作为铁源在15ml 乙二醇中恒温50℃剧烈搅拌；反应完毕后，将上述溶液转移到特氟龙反应釜中，在200℃下加热10h；待上述反应结束，对反应釜中的磁性纳米粒子外加磁场，同时倾去未被磁力吸附的溶液，加入适量去离子水对磁性纳米粒子清洗2~3次后，用无水乙醇清洗2~3次，最终可得25nmMNPs 的磁性纳米粒子。

优选地，所述步骤二具体包括以下步骤：取25%戊二醛与氨基化磁性纳米粒子以4:1的比例混合，在恒温30℃下孵育2个小时，待戊二醛与氨基化磁性纳米粒子结合完毕，用pH7.4的PBS缓冲液清洗2至3次，加入pH7.4的PBS缓冲液，在0℃冰浴下反应6小时使三磷酸双磷酸酶与已连接上羧基的磁性纳米粒子结合，浓度为4U/mL，将三磷酸双磷酸酶固定在磁性纳米粒子上，用去离子水清洗固定化酶，洗去未被固定的三磷酸双磷酸酶，得到固定化三磷酸双磷酸酶。