[发明专利]利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法

权利要求书

1.利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将外接信号基因的B-domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件；

(2)将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中，然后将家兔受精卵在FBS B₂培养液和35℃～40℃、3％～7％CO₂培养箱中培养10-20h，之后将分裂成2～8个细胞的家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因家兔；

(3)将所述乳腺表达构件通过转染至家兔供体细胞中，然后将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因家兔。

(4)步骤(2)和步骤(3)获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述质粒载体为pBC₁质粒载体。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳腺表达构件包括调控元件，所述调控元件为鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳腺表达构件包括调控元件，所述调控元件为鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段、CMV增强子。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述信号基因为bGHployA。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乳腺表达构件在显微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分；

步骤(3)中，所述乳腺表达构件在转染至家兔细胞之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述卵母细胞为滤泡卵母细胞或输卵管卵母细胞，所述家兔供体细胞为胚胎细胞、成纤维细胞和卵丘细胞中的一种。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述重组人第八凝血因子为B-domain缺失的重组人第八凝血因子。