[发明专利]一种Kunitz型海葵蛋白酶抑制剂及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种海葵蛋白酶抑制剂，及其编码基因与应用。

背景技术

目前已发现数百种丝氨酸蛋白酶抑制剂，它们被划分为十几个家族，动物体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂主要分布在Kunitz、Kazal、Serpin和α-巨球蛋白四个家族。其中，Kunitz型蛋白酶抑制剂含有一个或多个由约60个氨基酸残基编码的Kunitz结构域，该结构是其主要功能区，主要对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制作用。Kunitz型蛋白酶抑制剂来源非常广泛，现在已经从牛胰脏、猪胰脏、人尿、蛇、天花粉、海芋、苦豆子、花生、刺桐、太湖蓝藻、苦荞、赤小豆、大豆、海葵等动植物中分离出kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，它们的相对分子质量从几千到十几万大小不等，组成的氨基酸数量从几十到几百。这些来自不同动植物的蛋白酶抑制剂都有相似的结构和功能，它们的一级结构有相似的同源性。对于kunitz胰蛋白酶抑制剂，科学家以牛胰蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂研究最为深入。

植物蛋白酶抑制剂对许多植食性昆虫的生长发育有明显的抑制作用。植物蛋白酶抑制剂使昆虫肠道中的蛋白酶的协调性受到破坏，造成必需氨基酸的缺乏，从而使昆虫的生长发育受阻，甚至死亡。牛胰蛋白酶BPTI也在临床上得到了广泛的应用，它是一种多功能抑制剂，能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、溶血纤维蛋白酶及各种组织或血浆激肽释放酶。已广泛应用于治疗急性胰腺炎，烧伤后的休克，以及产后大出血等疾病，有独特的疗效。

海葵中含有大量的多肽毒素和蛋白质，例如毒素类化合物和蛋白酶抑制剂等，尤其是在他们的刺丝囊中，海葵毒素被认为是一种化学防御武器。目前，对于海葵Kunitz型蛋白酶抑制剂及其功能的研究十分有限。有研究表明海葵Kunitz型蛋白酶抑制剂既有钾通道蛋白阻止作用，也有蛋白酶抑制作用，是一种双功能的蛋白（B,Vasconcelos V,Antunes A.Sea anemone(Cnidaria,Anthozoa,Actiniaria)toxins:an overview.Mar Drugs.2012;10(8):1812-51.）。

随着对海葵蛋白酶抑制剂的结构和功能研究的不断深入，海葵KUNITZ型蛋白酶抑制剂在临床及农业方面的应用也有着更大的潜力。

发明内容

本发明目的是提供一种海葵来源的Kunitz型蛋白酶抑制剂，及其编码基因。本发明的另一目的是提供所述的Kunitz型蛋白酶抑制剂在制备治疗急性胰腺炎、急性出血药物以及杀虫剂中的应用。

本发明中所用海葵为巨型列指海葵（Stichodactyla gigantea），采自南海海域。经过对该地毯海葵的触手进行蛋白质分离，获得了分子量约6KD的海葵蛋白酶抑制剂SGPI-1，对SGPI-1进行N端测序，得到N端的20个氨基酸序列。

进一步地，在此基础上，设计并合成引物，从海葵触手总RNA中扩增出SGPI-1的编码序列，获得了SGPI-1的cDNA全长序列，其cDNA全长为171bp，将序列进行同源序列比对，结果显示与已报道的海葵蛋白酶抑制剂核酸序列不完全相同，是一个新的毒素蛋白。

ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）氨基酸序列比对结果表明，SGPI-1与Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族其他成员如SHPI-1（GI：225713716）、SHPI-2（GI：3024045）、ITR-4（GI：125017）、kalicludin-3（GI：55976205）的同源性分别为90%、86%、74%、58%。

本发明的第一方面，是提供了一种海葵来源的Kunitz型蛋白酶抑制剂，该蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二方面，是提供了一种海葵来源的Kunitz型蛋白酶抑制剂的编码基因，该编码基因为如下(ⅰ)或(ⅱ)的DNA分子：

(ⅰ)SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

(ⅱ)在严格条件下与(ⅰ)限定的DNA序列杂交且编码所述Kunitz型蛋白酶抑制剂的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

本发明的第三方面，是提供所述的海葵来源的Kunitz型蛋白酶抑制剂在制备治疗急性胰腺炎、急性出血药物以及杀虫剂中的应用。