[发明专利]一种重组脂氧合酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种重组脂氧合酶及其制备方法。

背景技术

脂氧合酶（LOX）是含有非血红素离子的双加氧酶，广泛存在于需氧生物中，包括植物、动物和低等水生生物中，可催化含（Z,Z）-1,4戊二烯结构单元的不饱和脂肪酸的加氧反应，产生不饱和脂肪酸的过氧化物，参与植物的萌发、生长、发育、衰老、植物抗病和抗伤害等多种生理功能，以及动物中涉及炎症反应。

LOX的产物——氢过氧化脂肪酸在其他酶的作用下最终生成茉莉酸、白三烯以及短链芳香性化合物，其中的短链芳香性化合物广泛应用于食品、日化以及医药工业等，如氢过氧化物裂解酶（HPL）催化产生的多种天然短链香料物质会散发出青草香、草药香、花香、菌菇香、肉香、木香等多种自然的香味，广泛添加于食品、日用化妆品、医药辅料等，由于天然的香料不具有毒物质，因此比化学合成的香料更受欢迎，当然价格也更高。

现有技术中脂氧合酶均为单功能酶，只催化脂肪酸的氢过氧化反应，而要形成短链香料，必须要有HPL对其产物继续分解产生，而两种酶体系的反应条件复杂，较难控制，不适合大规模生产，且一般酶法合成短链类香料所用的反应酶均为从植物中提取的粗酶液，如中国专利CN1563310A、CN101225406A，该种粗酶液中酶种类多、酶活不稳定，导致产物不稳定，不适合生产化。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供含有所述的PhLOX的cDNA序列的表达载体和利用该表达载体转化的重组微生物。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述的重组微生物制备PhLOX的过程。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种脂氧合酶PhLOX的cDNA序列，它的核苷酸序列如SEQID NO.1所述，为获得重组脂氧合酶PhLOX的cDNA序列，提取一种红藻门坛紫菜叶状体的总RNA，设计特异性引物克隆该坛紫菜脂氧合酶核心片段，然后以该脂氧合酶核心片段为模板，设计用于3’端和5’端延伸的特异性引物，进行RACE扩增得到完整的开放阅读框，获得扩增产物，将扩增序列与GeneBank数据库系列进行相似性搜索，发现其非血红素铁活性区域的氨基酸序列与其它动植物的保守性高，可以确定该序列是脂氧合酶类基因全长cDNA，碱基序列总长为3288bp，包含一个完整的编码框。

所述的PhLOX核苷酸序列和推断的氨基酸序列表明PhLOX cDNA与现有的脂氧合酶相比，是新的一种LOX，PhLOX的氨基酸序列如SEQID NO.2所述，具有898个氨基酸序列，蛋白大小约为98.7KDa。通过多重序列比对分析发现，其在非血红素铁活性区域的氨基酸序列与其他动植物的保守性高。

在表达载体中插入这样克隆的新的PhLOX cDNA序列，并且导入宿主细胞如大肠杆菌中表达重组PhLOX，作为优选，表达载体为LOX-28a，宿主细胞为E.coli BL21。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明从较低等的真核生物-红藻门坛紫菜中提取脂氧合酶基因，与高等真核生物中的脂氧合酶基因相比，该脂氧合酶基因进化度低，未出现功能分化，使得该基因编码的脂氧合酶可以一酶执行多酶功能，且没有严格的底物专一性，可以形成多种结构的下游产物；利用基因克隆的方法制得的重组脂氧合酶，酶纯度高，酶活稳定，适合工业化生产。

附图说明

图1为RACE产物的SDS-PAGE反应结果示意图；

图2为目的蛋白PhLOX催化游离不饱和脂肪酸的LC示意图；

图3为目的蛋白PhLOX催化游离不饱和脂肪酸的利用率示意图；

图4为PhLOX催化亚麻酸反应过程示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明选取坛紫菜叶状体的DNA和总cDNA为模板，克隆脂氧合酶全基因，并选取大肠杆菌E.coli BL21为表达系统，实现了对PhLOX的表达，并通过多不饱和脂肪酸的酶解分析，确定其多功能的特征。

实施例1：PhLOX全长cDNA序列的克隆

以CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取坛紫菜叶状体的基因组DNA，步骤如下：

1)65℃水浴预热2%CTAB抽提液后，分装15mL抽提液到50mL离心管中，加入0.1%的巯基乙醇，混匀待用；