[发明专利]重组大肠杆菌高密度发酵的方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是：该方法包括：采用三级菌种保藏方法，将构建后的重组大肠杆菌进行保藏，并经过活化、摇瓶培养、种子罐培养后转入发酵罐进行通气搅拌发酵罐培养，在发酵罐培养过程中通过提高搅拌转速及空气流量来保证溶氧水平，并根据pH的变化调整补料速度，当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是：所述的三级菌种保藏方法包括：

①原始菌种库的建立：将构建好的重组大肠杆菌以1%-2%的接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，然后与灭过菌的等量质量浓度为20%的脱脂奶充分混匀，无菌条件下分装至200ul安瓿管中，真空冷冻干燥后封口，于-80℃冰箱中保存；

②主代菌种库的建立：原始菌种库检验合格后，10ml摇管活化6-8h，然后以1%-2%的接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，再与灭过菌的等量质量浓度为20%的脱脂奶充分混匀，无菌条件下分装至200ul安瓿管中，真空冷冻干燥后封口，于-80℃冰箱中保存；

③工作菌种库的建立：主代菌种库检验合格后，10ml摇管活化6-8h，然后以1%-2%接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，再与灭过菌的70%甘油以7:3的比例混合，无菌条件下分装至1ml EP管中，于-80℃冰箱中保存。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是：所述的活化是将工作菌种库中的菌种在斜面培养基中进行划线培养24h，然后接种于50ml液体培养基中摇床活化培养6-8h，所述的斜面培养基包括：蛋白胨1%-1.5%，酵母抽提粉0.5%-1%，NaCl 0.5%-1%，琼脂粉1.5%-2.0%，pH6.8-7.0。

4.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是：所述的摇瓶培养是指将摇床活化培养后的菌种转接于500ml液体培养基中摇床培养6-8h，制得摇瓶种子液，所述的培养液包括蛋白胨1%-1.5%，酵母抽提粉0.5%-1%，NaCl 0.5%-1%，pH6.8-7.0。

5.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是：所述的种子罐培养是将摇瓶种子液以1%-2%的比例接种于灭过菌的种子罐中，通气搅拌培养4-6h，培养条件：转速200-400rpm，通气量0.5-1.5vvm，温度35-37℃，罐压0.03-0.07MPa，所述的种子罐培养的培养基包括：蛋白胨1%-1.5%，酵母抽提粉1.5%-2.0%，NaCl 0.5%-1%，葡萄糖1%-2%，KH₂PO₄ 0.05%-0.1%，K₂HPO₄ 0.1%-0.3%，pH6.8-7.0。

6.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是：所述的发酵罐培养是将种子罐中种子液以1%-2%的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养，初始培养条件：转速100-120rpm，通气量0.5-1.0vvm，温度35-37℃，罐压0.03-0.07MPa，当溶氧低于20%后，逐步提高转速至400rpm，通气量至2.0vvm，控制pH7.0-7.1，根据pH调整补料，发酵OD600至30以上时，加入诱导剂，降温并继续培养10-16h，初始培养基包括：蛋白胨1%-2%，酵母抽提粉1.5%-2.5%，NaCl 0.5%-1%，葡萄糖0.5%-1%，KH₂PO₄ 0.15%-0.25%，K₂HPO₄ 0.3%-0.4%，MgSO₄ 0.05%-0.1%，pH 6.8-7.0；补料培养基包括：蛋白胨3%-5%，酵母抽提粉6%-8%，甘油10%-20%，ZnSO₄ 0.4%-0.8%，CaCl₂ 0.3%-0.5%，CoCl₂ 0.1%-0.3%，MgSO₄ 1%-3%，pH5.0-5.2。

7.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是：所述的当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束是指发酵OD₆₀₀至30以上时加入诱导剂，加入诱导剂后将发酵罐温度由35-37℃降为25-27℃，所述的诱导剂为0.2% L-阿拉伯糖和/或1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。