[发明专利]稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系及其在制备猪瘟疫苗与诊断试剂中的应用

权利要求书

1.一种用于预防猪瘟的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中含有经稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白及佐剂，其中所述的E0-E1-E2蛋白为病毒样颗粒抗原。

2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于所述的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No．1所示。

3.如权利要求1或2所述的疫苗组合物，其特征在于所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系是通过以下方法构建得到的：

(1)构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中插入的编码猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的cDNA序列；

(2)将所述真核表达质粒转染BHK-21细胞；

(3)经质粒转染的细胞以添加了G418的培养液选择培养；

(4)将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白的表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系。

4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于所述的编码猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的cDNA序列如SEQ ID No．2所示。

5.根据权利要求1-4中任何一项的疫苗组合物，其特征在于稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系为BCSFV-E012，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.7720。

6.稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系，命名为BCSFV-E012，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.7720。

7.由权利要求6所述的BHK细胞系所表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白，其特征在于所述的E0-E1-E2蛋白在细胞内表达能自组装成为病毒样颗粒蛋白。

8.权利要求6所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系或其培养物在制备预防猪瘟病毒病疫苗药物中的应用，其中所述的培养物为由表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白自组装形成的病毒样颗粒蛋白。

9.权利要求6所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系或其培养物在制备诊断或检测猪瘟病毒感染试剂中的应用，其中所述的培养物为由表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白自组装形成的病毒样颗粒蛋白。

10.一种制备权利要求1-5任一项所述的预防猪瘟的疫苗组合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将权利要求6所述的BHK细胞系BCSFV-E012正常传代后长至90%满时，换血清含量为1～2%（v/v）的低血清培养基继续培养4-6d，收获细胞培养上清液存于4℃；

（2）细胞上清液经截留分子量为100kD超滤浓缩后调整至E2抗原ELISA效价为1：32至1：64后，加入终浓度为0.02%（w/w）硫柳汞后为疫苗抗原液；

（3）疫苗抗原液与油佐剂按体积比为1：1.5进行混合并充分乳化，即得。