[发明专利]稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用，具体地，本发明涉及的重组细胞系是BCSFV-E2，其保藏编号为：CGMCC No.7719。本发明还公开了制备所述重组细胞系的方法和该重组细胞系在制备预防猪瘟疫苗以及在制备诊断或检测猪瘟病毒感染试剂中的应用。属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。 

背景技术

猪瘟（Classical swine fever,CSF）又称猪霍乱（Hog cholera,HC）是由猪瘟病毒（Hog Cholera virus,HCV或Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性热性致死性疾病，猪瘟具有高度接触传染性，流行广泛，发病与死亡率高，危害极大。国际兽疫局(OIE)以前将其定为A类传染病，现将期列为通报疫病，我国将其列为一类动物疫病。 

猪瘟在世界范围内都有发病流行，对养猪业危害极大。目前对该病的有效预防措施为疫苗免疫。其中由中国科学家研究成功的猪瘟弱毒疫苗（C株）对世界范围内猪瘟防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被我国等多个国家使用。而且在此弱毒疫苗株的基础上开发出了乳兔苗，免脾淋苗，原代细胞苗及传代细胞苗等多种形式的弱毒疫苗。但组织苗的生产需要大量健康动物，生产过程中人工劳动强度大，成本高，有接种副反应等等这些不利因素影响了此类疫苗的实际应用。而以培养细胞繁殖弱毒生产疫苗同样也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清中BVDV及抗体会干扰病毒生长，病毒抗原滴度难以提高，弱毒疫苗需要全程冷链保藏等等均导致弱毒疫苗的最终使用效果受到影响。而且所有弱毒疫苗在实际合用过程中均易受母源抗体影响，这也是导致免疫失败的因素之一。 

CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个大的多聚蛋白含3898个氨基酸残基，分子量约为438kDa。多聚蛋白在翻译的同时和翻译 后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白有C、E0、E1和E2蛋白。E2蛋白为CSFV的一种重要的囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白可诱导产生病毒的中和抗体，是猪瘟病毒主要的免疫保护性抗原。也是研究猪瘟基因工程疫苗是重要靶蛋白。鉴于现有猪瘟疫苗的种种缺陷与不足，以及随着现代基因工程技术与细胞生物工程技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗，大肠杆菌表达蛋白的亚单位疫苗，昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单疫苗。其中至目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断。如Hulst[Hulst,et al.Cytotechnology,20(1-3):271-277]用20μg昆虫细胞表达的E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗100LD50CSFV Brescia毒株强毒的攻击。该疫苗已于上世纪九十年代在欧洲批准上市，在欧洲国家的猪瘟根除计划中发挥了重要作用。但该疫苗是通过昆虫杆状病毒表达系统表达的，该表达系统相对原核表达系统而言，蛋白表达后可以在一定程度上进行翻译后加工与修饰。但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定差异，蛋白表达后折叠与修饰不如哺乳动物细胞表达系统。而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度。 

本研究组在本发明中探索了不同表达细胞系表达猪瘟病毒E2蛋白，并最终找到合适表达细胞系，克服了表达猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白对细胞毒性作用，以及建立了大规模筛选等技术。结果成功制备了表达猪瘟病毒结构蛋白E2蛋白细胞系。该细胞系表达E2蛋白表达量高，易于纯化,培养细胞表达抗原蛋白可以连续收获，易于生产。表达的E2蛋白抗原能对免疫猪诱导产生良好的免疫反应。该细胞系表达抗原所制备的疫苗可为猪瘟的预防提供新型、高效的预防制剂。对我国乃至世界范围内猪瘟的预防控制可以发挥重要作用。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种安全，高效的猪瘟亚单位疫苗。 

本发明的目的之二是提供一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。 

本发明的目的之三是提供一种构建上述稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞 系的方法。