[发明专利]一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及肽聚糖的制备方法，尤其是涉及一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法。

背景技术

乳酸菌作为一种重要的肠道益生菌，在调节肠道微生物菌群、增强机体免疫力及预防肿瘤等疾病中具有重要作用。嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中重要一员，在调整肠道菌群平衡、降低血清胆固醇水平及刺激免疫系统、提高免疫功能等方面起着重要作用。嗜酸乳杆菌发挥免疫调节作用的原理主要是其肽聚糖通过诱导各种细胞因子的释放进而调节宿主的免疫功能。

肽聚糖（peptidoglycan,PG），是细菌细胞壁的主要组成成分之一，它的单体是由一个四肽尾和一个双糖单位构成。不同细菌的肽聚糖，其肽链的组成、长度及结构排列有很大变化，肽桥变化也甚多，溶解性和功能也不一样，具有多样性。如Reid G, Sakato Y等人在2003年37卷第2期《J Clin Gastroenterol》中对双歧杆菌肽聚糖进行了研究，发现肽聚糖是双歧杆菌发挥抗感染、抗肿瘤以及免疫活性等多种生理功能的主要成分；《中国微生态学杂志》1999年11卷第3期中，蓝景岗等发现PG能增强小鼠脾N K、LAK细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性；孙涛等在2007年《吉林农业大学学报》中初步研究发现嗜酸乳杆菌La2细胞壁肽聚糖能显著抑制荷瘤小鼠S-180肉瘤的生长，提高荷瘤小鼠的脾指数及肾上腺指数。尽管PG具有较好的医学价值，但目前国内外对其研究报道甚是少见，原因在于它本身溶解度低的特性，大大影响了其功效的发挥。现阶段人们采用溶菌酶水解PG，破坏PG的β-1,4糖苷键结构，使PG的分子结构由大分子变成小分子，提高PG的溶解性。但溶菌酶价格昂贵，耗时较长，酶活力不容易控制，且得到的PG分子结构发生变化较大，不利于PG功效的研究及工业化。因此，对PG分子结构进行修饰显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单，反应时间短，且溶解性显著增加、抗氧化活性明显提高的改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，包括以下步骤：

   （1）湿菌体的制备

    将嗜酸乳杆菌置于三角瓶中，于60-70℃水浴35-45min 加热杀死菌体，然后加入0.5%Triton X-100溶液，于80-90℃水浴0.5-1.5h，并不断连续搅拌，取出溶液置冰浴中立即冷却，于10000×g-15000×g离心8-12 min后弃上清，将沉淀再用双蒸水充分洗涤两次，再次于10000×g-15000×g离心8-12 min后弃上清，然后用甲醇-水、甲醇依次洗涤去除沉淀中的杂质后得到湿菌体；

   （2）酶解破壁

将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中，于35-40℃水浴10-14 h，再于4℃、10000×g-15000×g离心30-50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于35-40℃水浴10-14 h，再于4℃、10000×g-15000×g离心30-50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于35-40℃水浴处理20min，再于4℃，10000×g-15000×g离心30-50min弃上清取沉淀；

   （3）去脂去蛋白

    将步骤（2）所得沉淀依次经甲醇、甲醇-氯仿及氯仿洗涤脱脂，于10000×g-15000×g离心35-45min后弃上清，取脱脂后的沉淀加入一定量的酶溶液Ⅳ中，于35-40℃消化10-15h，再于4℃，10000×g-15000×g离心30-50min，取沉淀加入酶溶液Ⅳ进行消化离心重复3次弃上清，得到去脂去蛋白沉淀；

   （4）纯化

将步骤（3）得到的去脂去蛋白沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5-3.5d后，经0.01 mol/L的硫酸溶液于85-95℃ 处理5min后，冰水浴中立即冷却，再于4℃ 、10000×g-15000×g离心25-35min弃上清, 取沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5-3.5d，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖；其中硫酸溶液与原料嗜酸乳杆菌的比例为2mL：3g；

    （5）TEMPO-NaClO-NaBr选择性氧化修饰