[发明专利]含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白及展示RBD蛋白的杆状病毒

权利要求书

1.一种含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白SP-RBD-TM，其特征在于，该蛋白是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成。

2.根据权利要求1所述的含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白SP-RBD-TM，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求2所述的含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒是由权利要求3所述重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒。

5.根据权利要求4所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，所述供体质粒为pFastBacDual，重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因插入到供体质粒pFastBacDual的pPolh启动子下，构建成重组转座质粒后再与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组。

6.根据权利要求5所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。

7.权利要求4~6任一所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）PCR扩增获得杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因、SARS病毒的RBD蛋白的编码基因和杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因；

（2）通过重叠PCR扩增的方法拼接步骤（1）获得的三种基因序列，得到重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因，再将编码基因片段连接到载体pFastBacDual的pPolh启动子下，构建成重组转座质粒；

（3）重组转座质粒转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，白斑继续培养24~48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；

（4）取步骤（3）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒；

所述PCR鉴定使用如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9所示的引物序列。

8.根据权利要求7所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4~5所示；扩增SARS病毒RBD蛋白的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:6~7所示；扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:8~9所示。

9.权利要求4~6任一所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒在制备SARS疫苗中的应用。