[发明专利]猪瘟、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种猪瘟、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法。

背景技术

核酸序列依赖性扩增检测技术（Nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）是一项以核苷酸模板序列为模板进行等温核酸扩增的检测方法（Compton,J.,Nucleic acid sequence-based amplification.Nature,1991.350(6313):p.91-92.），该方法的扩增过程是由一对特异性引物介导的、连续均一的等温酶促扩增反应过程。NASBA法扩增反应简单快速，约2小时可将RNA扩增10⁹至10¹²倍，相比常规PCR反应扩增产物量至少高1000倍，且不需要特殊的大型仪器。NASBA扩增反应的高效性还在于扩增过程受到初始样本中RNA浓度的影响很小，反应在42℃下进行，扩增产物的积累量与时间呈指数相关，扩增产物达到10⁵倍仅需15分钟，而PCR扩增则需要85分钟。

猪瘟病毒（又名古典猪瘟病毒Classical Swine Fever Virus，CSFV）是威胁养猪业的一种主要传染病。尽管分离到不同的变异性毒株，但目前认为猪瘟病毒为单一血清型（Kaden,V.and B.Riebe,Classical swine fever(CSF):ahistorical review of research and vaccine production on the Isle of Riems.Berl Munch Tierarztl Wochenschr,2001.114(7-8):p.246-251）。

猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）又称猪蓝耳病病毒，依据血清学及基因序列分析，分为以LV型为代表的欧洲型亚型和以VR2332为代表的美洲型亚型，这两种不同基因型的病毒的核苷酸序列同源性约为60％（Shang,Y.,et al.,Pathogenic characteristics of three genotype II porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated from China.Virol J,2013.10:p.7.）（张松林等，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的免疫学和免疫逃避研究进展，病毒学报，2012.28(6):p.689-698.）。

猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）也是一种高度接触性传染性动物病毒，到目前为止，世界各地所分离的TGEV毒株均属同一个血清型（Laude,H.,et al.,Molecular biology of transmissible gastroenteritis virus.Vet Microbiol,1990.23(1-4):p.147-154.）。

目前，虽然有利用NASBA技术对这三种病毒的单一检测方法已有所报道，但是还没有通过一次NASBA扩增而筛查出待测样品中是否存在上述病毒中的一种或几种的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服目前存在的不能通过一次性检测得知样品中是否存在猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒中的一种的缺陷，提供了一种试剂盒和一种猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒检测方法。

根据本发明所提供的试剂盒，该试剂盒包括一个引物扩增试剂、一个初筛探针试剂和4个复筛探针试剂；

其中，所述引物扩增试剂中包括3个引物对：

第一对引物对由SEQ ID NO:1所示的引物和SEQ ID NO:2所示的引物组成，

第二对引物对由SEQ ID NO:3所示的引物和SEQ ID NO:4所示的引物组成，

第三对引物对由SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的引物组成，

其中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针，所述5个初筛探针的序列分别为SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:11所示的探针；

其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对：