[发明专利]一种制备热稳定的包含氧载体的组合物的方法

权利要求书

1.一种由以下方法形成的非聚合的交联四聚体血红蛋白，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离；

c)过滤与血浆分离的红细胞从而获得滤过的红细胞级分；

d)洗涤所述滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质，得到洗涤过的红细胞；

e)在快速细胞裂解设备中通过精确控制的低渗裂解方法破裂所述洗涤过的红细胞2-30秒或足以裂解所述红细胞的时间，从而以50-1000升/小时的流速形成包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物；

g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；

h)使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成去除分子量比血红蛋白高的杂质，以从第一血红蛋白溶液中进一步去除任何病毒和残留废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液；

i)对该纯化的血红蛋白溶液进行流通柱色谱以去除蛋白杂质；

j)使用超滤滤器进行第二超滤过程，所述超滤滤器被配置成去除杂质和浓缩所述纯化的血红蛋白溶液；

k)在缺氧环境中通过富马酸二-3,5-二溴水杨酸酯至少交联所述血红蛋白的α-α亚单位以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是非聚合的交联四聚体血红蛋白；

l)用合适的生理缓冲液交换在步骤k)中形成的交联溶液；

m)通过切向流过滤去除任何残留的化学物质；

n)在缺氧环境中热处理所述交联血红蛋白从而使任何残留的未反应的血红蛋白、不稳定的血红蛋白和任何其他蛋白杂质变性并沉淀，使得得到的热稳定的交联四聚体血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚体血红蛋白组成；

o)在热处理所述交联四聚体血红蛋白后立即加入N-乙酰半胱氨酸从而保持低水平的高铁血红蛋白；和

p)通过离心或过滤设备去除沉淀物以形成澄清溶液从而获得纯化的和热稳定的交联四聚体血红蛋白。

2.根据权利要求1所述的非聚合的交联四聚体血红蛋白，其中步骤n)所述的不稳定的血红蛋白是血红蛋白二聚体。

3.根据权利要求1或2所述的非聚合的交联四聚体血红蛋白，其中所述热处理是在70°C-95°C下进行30秒至3小时的短时间高温过程，然后立即冷却并且在冷却后立即加入0.2-0.4%的量的N-乙酰半胱氨酸。