[发明专利]一种识别6个氨基酸标签的单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种识别6个氨基酸标签（LT-tag）的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

pET载体系统是一种能够有效地在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白的系统。pET载体系统已提供了多种商业化的、可满足各种不同应用需求的载体质粒。载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因。翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因。pET-28(+)和pET-32(+)是常用的翻译载体。

发明内容

pET-28(+)和pET-32(+)是原核生物蛋白表达中常用的表达载体，为了便于鉴定、纯化利用这两个载体表达的重组蛋白，本申请的发明人设计在这两种载体的N端寻找一段合适的序列作为重组蛋白的标签并制备特异性的单克隆抗体。抗原决定簇鉴定结果发现本发明制备的单克隆抗体能特异性地结合SSGLVP的氨基酸多肽序列，该单克隆抗体灵敏度高，能够用于含有SSGLVP标签序列的重组蛋白以及pET-28(+)和pET-32(+)载体表达的重组蛋白的检测和纯化。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性地结合SSGLVP的氨基酸多肽序列。

本发明的第三个目的在于提供表达所述单克隆抗体的细胞株。

本发明的第四个目的在于提供所述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将如SEQ ID NO：1所示的DNA片段与pET-28a(+)载体连接，将构建得到的重组质粒表达外源蛋白并作为抗原免疫Balb/c小鼠，进行细胞融合，经过筛选后得到所述单克隆抗体。

本发明的第四个目的在于提供所述单克隆抗体用于检测和纯化含有SSGLVP标签序列（LT-tag）的重组蛋白及由pET-28(+)和pET-32(+)载体制备的重组蛋白的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的单克隆抗体灵敏度高，在1：5000的使用浓度下能够检测到约0.05μg的蛋白样品，能够应用于含有SSGLVP标签序列（LT-tag）的重组蛋白及由pET-28(+)和pET-32(+)载体制备的重组蛋白的检测和纯化。

附图说明

图1为F1～F11DNA片段的PCR扩增鉴定结果。

图2为重组质粒pMAL-F1～pMAL-F11的酶切鉴定结果。

图3为重组质粒pMAL-F1～pMAL-F11的SDS-PAGE鉴定结果。

图4为重组质粒pMAL-F1～pMAL-F11与LT-tag单克隆抗体的Western blotting检测结果。

图5为BIOEDIT软件的蛋白序列分析结果。

图6为蛋白样品与不同浓度的LT-tag单克隆抗体的Western blotting检测结果。

图7为1：5000稀释的LT-tag单克隆抗体与不同浓度的蛋白样品的Western blotting检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1、LT-tag单克隆抗体的制备

合成如SEQ ID NO：1所示的DNA片段，利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点连接到pET-28a(+)载体上。将构建得到的重组质粒表达外源蛋白并作为抗原免疫Balb/c小鼠，并用常规的方法进行细胞融合，经过筛选后得到特异性抗LT-tag的单克隆抗体。

实施例2、LT-tag单克隆抗体抗原决定簇的鉴定

2.1、引物设计

以一条长度为738bp的DNA序列（SEQ ID NO：2）为共表达DNA序列，利用软件BIOEDIT进行截短序列的对比分析，设计前端带有不同分段DNA序列的引物。引物特征如表1所示。其中，NP-R引物包含HindⅢ酶切位点；NP-F1～NP-F11引物包含EcoRⅠ酶切位点。

表1、引物名称及序列

2.2、目的DNA的扩增