[发明专利]利用重组微生物生产生物燃料

权利要求书

1.重组微生物，其包含具有2-酮酸脱羧酶活性的异源基因和/或和具有醇脱氢酶活性的异源基因，其中所述重组微生物以0.12-0.41g异丁醇/g葡萄糖和/或0.12-0.42g异丁醇/g丙酮酸的产率产生异丁醇。

2.权利要求1的重组微生物，其中所述微生物在112小时的培养后产生低于240mg/L的乙醇。

3.权利要求1或2的重组微生物，其中当在相似的条件下培养时，通过以0.12-0.41g异丁醇/g葡萄糖和/或0.12-0.42g异丁醇/g丙酮酸的产率产生异丁醇，所述微生物的醇生产状况与具有ATCC专利保藏名称PTA-8945(SA237)的微生物的醇生产状况基本相同。

4.权利要求1的重组微生物，其中异丁醇的产率为0.33-0.36g异丁醇/g葡萄糖和/或0.34-0.37g异丁醇/g丙酮酸。

5.权利要求1的重组微生物，其中异丁醇的产率为在16-64小时的培养后0.36-0.40g异丁醇/g葡萄糖和/或在16-64小时的培养后0.34-0.37g异丁醇/g丙酮酸。

6.权利要求4或5的重组微生物，其中每克葡萄糖的乙醇产率为低于0.0037g/g和/或其中每克丙酮酸的乙醇产率为低于0.0038g/g。

7.权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物包含对乙酰CoA至乙醇的转化的降低或抑制。

8.权利要求1或7的重组微生物，其中所述重组微生物包含选自以下的一种或多种修饰：

(a)乙醇脱氢酶的表达减少；

(b)编码乙醇脱氢酶的一种或多种基因的部分缺失；和

(c)编码乙醇脱氢酶的一种或多种基因的敲除。

9.权利要求8的重组微生物，其中所述乙醇脱氢酶是AdhE，其同源体或变体。

10.权利要求1或7的重组微生物，其中所述重组微生物包含转化选自以下反应的一种或多种酶的表达或增加的表达：

(a)从丙酮酸转化为乙酰乳酸

(b)从乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸

(c)从2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸

(d)从α-酮异戊酸转化为异丁醛

(e)从异丁醛转化为异丁醇。

11.权利要求10的重组微生物，其中所述酶是2-酮酸脱羧酶，其选自Pdc、Pdc1、Pdc5、Pdc6、Aro10、Kivd、KdcA、前述各种酶的同源体或突变体，以及与前述任何一种酶具有至少60％同一性且具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。

12.权利要求11的重组微生物，其中所述2-酮酸脱羧酶由kivD基因或其同源基因编码。

13.权利要求11的重组微生物，其中使异丁醛转化为异丁醇的所述酶是醇脱氢酶。

14.权利要求13的重组微生物，其中所述醇脱氢酶选自Sfa1、Adh2、Adh1、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、前述任一酶的同源体或变体以及与前述任何一种酶具有至少60％同一性且具有醇脱氢酶活性的多肽。

15.权利要求1的重组微生物，其中，所述重组微生物包含基因的一处或多处缺失或敲除，所述基因编码酶，所述酶催化：丙酮酸转化为乙醇；乙酰-CoA转化为乙醇；丙酮酸转化为乳酸；延胡索酸转化为琥珀酸；乙酰-CoA和磷酸转化为CoA和乙酰磷酸；乙酰-CoA和甲酸转化为CoA和丙酮酸；乙酰-CoA的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代异戊酸)的缩合；2-异丙基苹果酸和3-异丙基苹果酸之间的异构化；a-酮酸转化为支链氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；丙酮酸转化为乙酰-CoA；支链氨基酸的形成；从苏氨酸生成a-酮丁酸；蛋氨酸生物合成的第一步反应；以及苏氨酸的分解代谢。

16.权利要求1或15的重组微生物，其中所述重组微生物包含选自下组基因的一处或多处基因缺失：adhE、ldhA、pflB、frdBC、fnr、pta、leuA、leuB、leuC、leuD、ilvE、tyrB、poxB、ilvB、ilvI、ilvA、metA、tdh和前述任一基因的同源基因及自然产生的变体。